孕酮免疫生物传感器在奶牛上的临床应用

钱伟东,张洪友,夏成,徐闯,吴凌,段宇

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319)

孕酮免疫生物传感器在奶牛上的临床应用

钱伟东,张洪友,夏成,徐闯,吴凌,段宇

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆163319)

为了解孕酮免疫生物传感器的临床应用效果,本试验对7头妊娠奶牛,8头产后发情奶牛和18头乏情奶牛的血浆雌二醇、促黄体素、促卵泡素和孕酮浓度进行了检测,同时应用的孕酮免疫生物传感器进行了乳汁孕酮检测.结果显示,孕酮免疫生物传感器检测的乳汁孕酮水平与ELISA检测血浆孕酮含量之间呈正相关.该优化的生物传感器检测奶牛妊娠的孕酮浓度范围为10～15 ng/mL,发情的孕酮浓度范围为4～10 ng/mL;持久黄体的孕酮浓度范围为10～ 16 ng/mL,卵巢静止的孕酮浓度范围为3～7 ng/mL,黄体囊肿的孕酮浓度范围为12～18 ng/mL.表明该孕酮免疫生物传感器能有效的检测奶牛妊娠、发情和繁殖障碍疾病的乳汁孕酮水平.

奶牛;孕酮;免疫生物传感器;妊娠;发情;乏情

孕酮水平不仅能反映机体正常生殖规律,而且能用于监测生殖系统疾病.在国外孕酮检测已成为牛群繁殖管理的重要检测指标之一[1].孕酮主要用于确定排卵、孕激素治疗监测和早期妊娠状态的评价.孕酮可以反映卵巢活动状态,是监测奶牛妊娠、发情以及预防和治疗奶牛繁殖障碍的有效指标,学者们对于免疫测定孕酮的方法有了大量的研究,利用酶联免疫法检测奶牛乳汁中孕酮的含量[2],利用全内反射萤光显微镜对牛乳中的孕酮进行检测,但还不适用于现场[3-5].本试验应用优化的孕酮免疫生物传感器对奶牛产后发情、妊娠和卵巢疾病的乳汁孕酮检测试验,旨在为今后奶牛发情、妊娠和繁殖障碍疾病的检测和诊断提供新的技术和判定依据.

1　材料与方法

1.1试验动物分组与样品处理在黑龙江省某集约化奶牛场,选取年龄、胎次及体况相近的健康荷斯坦奶牛7头,配种后10、15、20、25 d和30 d采血.直检确定这7头奶牛为妊娠牛.另选年龄胎次及体况相近的奶牛26头,其中健康发情奶牛8头,产后60、65、70、75 d和80 d采血和乳汁;黄体囊肿,卵巢静止和持久黄体各6头.上述的所有奶牛均采10 mL血样和5 mL乳汁,加肝素抗凝,3 000 r/min离心5 min,分离血浆,-80℃保存待检.

1.2主要检测项目和方法

1.2.1繁殖障碍病种类及判断持久黄体:直检, 7 d查1次,共查3次,一侧或两侧卵巢体积增大,卵巢内有持久黄体存在,突于卵巢表面.B超黄体组织呈致密中等回声,小梁呈明显强回声.卵巢静止:奶牛不发情,直检:卵巢上无卵泡和黄体,其体积变小,一侧卵巢上可能有黄体残留.B超检测无卵泡,卵巢明显小于正常.黄体囊肿:直检卵巢明显大于正常,内有直径约2 cm以上囊泡,泡壁有波动感.B超显示囊内有液体暗区,影像边缘光滑,轮廓清晰.

1.2.2血浆激素检测FSH(m IU/m L),ELISA法,试剂盒批号DZE50055,LH(m IU/mL),ELISA法,试剂盒批号DZE50054、P4(ng/mL)ELISA法,试剂盒批号DZE50056、E2(pg/mL)ELISA法,试剂盒批号DZE50060.这些试剂盒,购自卡迈舒上海生物科技有限公司.

1.2.3乳汁孕酮检测根据间接竞争ELISA法操作测定所有试验奶牛乳汁孕酮[6-7].

1.3数据处理应用SPSS17.0软件单因素方差分析进行数据分析,当差异显著时用Duncan氏检验法进行各组间的多重比较.组间比较,上标小写字母不同者差异显著(P<0.05),上标大写字母不同者差异极显著(P<0.01).

2　结果

2.1妊娠奶牛血浆E2,FSH,LH浓度表1说明血浆E2含量,在20 d达到最高之后开始下降;血浆LH含量,相对比较平稳,在30 d时达到最高, 15 d时水平最低;血浆FSH含量在15 d时最低,在20 d时升到最高,之后开始下降.

表1　妊娠奶牛血浆E2、FSH、LH浓度

2.2妊娠奶牛血浆孕酮浓度与乳汁孕酮浓度表2说明配种后10～30 d期间奶牛血浆和乳汁P4含量呈稳定上升趋势,且同时间点的乳汁孕酮含量均极显著高于血浆孕酮含量,呈正相关.在配种后20 d时进行检测,孕酮免疫生物传感器妊娠诊断范围应该为10～15 ng/mL.

表2　妊娠奶牛血浆孕酮浓度与乳汁孕酮浓度

2.3发情奶牛血浆中雌二醇、促卵泡素和促黄体素浓度表3显示了发情奶牛产后60～80 d血浆中E2、FSH、LH浓度的变化.E2浓度在产后60 d和80 d时处较高水平;LH含量在产后80 d达到最高,70 d时有小幅度上升;FSH含量在产后60 d时最高,在70 d时再次升高.

表3　发情奶牛血浆E2、FSH、LH的浓度

2.4发情奶牛血浆孕酮和乳汁孕酮浓度表4说明,发情奶牛产后血浆孕酮浓度在70 d最高,80 d和60 d水平最低,乳汁孕酮极显著高于血浆.在产后70 d进行检测,孕酮免疫生物传感器的发情判定范围4～10 ng/mL.

表4　发情奶牛血浆P4和乳汁P4浓度

2.5乏情奶牛血浆雌二醇、促卵泡素和促黄体素浓度表5说明,E2含量黄体囊肿奶牛高于其他两组,卵巢静止E2含量最低;FSH含量黄体囊肿奶牛高于其他两组,卵巢静止FSH含量最低;LH含量黄体囊肿奶牛要显著高于其他两组,卵巢静止含量最低.

表5　乏情奶牛血浆E2、FSH、LH浓度

2.6乏情奶牛血浆孕酮和乳汁孕酮浓度表6说明,卵巢囊肿孕酮含量最高,卵巢静止奶牛含量最低.乳汁孕酮极显著高于血浆孕酮浓度,并且乳汁孕酮含量和血浆孕酮含量呈正相关.孕酮免疫生物传感器持久黄体诊断范围为10～16 ng/ mL,卵巢静止诊断范围为3～7 ng/mL,黄体囊肿诊断范围为12～18 ng/mL

3　讨论

3.1生物传感器的优化孕酮传感器刚研制出来,各项的指标还有待完善.因此,对生物传感器特异性、灵敏性、重复性等各指标重新优化.应用碳化二亚胺法将11α-羟基孕酮半琥珀酸和OVA制备成孕酮完全抗原,其浓度达0.6 mg/mL.在此基础上建立了乳汁为基质的孕酮生物传感器的标准曲线y=-4.9461x+8.7982,R2=0.9932,进一步确立了检测乳汁孕酮的线性范围为0.31～50 ng/mL,检测限为0.31 ng/mL,灵敏度为0.15 ng/ mL,并丰富了孕酮与皮质酮、皮质醇、雄烯二酮的免疫交叉反应,特异性较好.

表6　乏情奶牛血浆孕酮和乳汁孕酮浓度

3.2妊娠奶牛生殖激素的变化结果显示,在配种后妊娠奶牛10～30 d血浆LH含量,相对比较平稳.血浆及乳汁P4含量从10～30 d呈稳定上升趋势,并且各时间点的乳汁孕酮含量均极显著高于同时间点的血浆孕酮含量.FSH能刺激卵巢增重和生长发育,增加雌激素的合成和分泌[8].哺乳动物卵泡的征集和优势化离不开FSH的参与,促卵泡素和LH通过脑垂体和下丘脑的反馈,在卵泡的选择过程和排卵数的确定中发挥着极其重要的作用[9-10].

3.3发情奶牛生殖激素的变化结果显示了发情奶牛产后60～80 d血浆孕酮浓度在70 d最高,乳汁孕酮极显著高于血浆孕酮含量.在产后70 d进行检测,孕酮免疫生物传感器的发情判定范围4～10 ng/mL.牛发情初期孕酮的水平是非常低的,发情后持续上升,发情期第15天后下降,发情周期末,黄体逐渐退化,进入卵泡期,并表现发情.在发情周期中,E2的分泌在发情期与P4变化恰好相反.所以引起发情行为的激素变化特征是孕酮水平的下降,随后雌激素的迅速上升.

3.4乏情奶牛生殖激素的变化结果显示,该场乏情奶牛血浆LH和FSH的含量处于较低水平,没有波动峰值,但现在还没有证据能说明FSH是产后乏情的限制因素.数据表明,FSH对产后卵巢周期的发生起作用是随意的,可能有一个浓度阈值,低于该阈值时,FSH可限制产后母牛卵巢活动,因此乏情期延长的母牛,其血浆中FSH浓度显著低于发情典型的母牛.该场乏情奶牛血浆E2含量也显著性的低于发情组,产后早期乏情母牛卵巢出现了潜在性活动,但这种低水平的E2并不能诱导发情和排卵,故而不能正反馈作用于下丘脑-垂体-卵巢轴,不能释放排卵前LH峰.

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The Clinical App lication of the Optim ized Progesterone Immune Biosensors in Dairy Cows

QIAN Wei-dong,ZHANG Hong-you,XIA Cheng,XU Chuang,WU Ling,DUAN Yu
(College of animal science and veterinary medicine,Heilongjiang Bayi agricultural university,Daqing 163319,China)

In this study,7 pregnant cows,8 estrus cows postpartum and 18 anestrus cows were selected to Study the clinical effect of the biosensor on monitoring milk progesterone.Plasma concentration of estradiol,luteinizing hormone,follicle-stimulating hormone and progesterone from those cows were measured using the commercial ELISA kits,while milk progesterone concentra⁃tions in those cows were also detected using the optimized immune biosensor.Results showed that levels of progesterone in milk were positively correlated with the levels of progesterone in plasma in those cows.For the optimized immune biosensor,the detect⁃ing range of progesterone in milk was 10～15 ng/mL,4～10 ng/mL,10～16 ng/mL,3～7 ng/mL,12～18 ng/mL in dairy cows with pregnancy,estrus,persistent corpus luteum,inactive ovary and corpus luteum cyst,respectively.In onclusion,our findings in⁃dicate that the progesterone immune biosensor can effectively detect the progesterone level of pregnancy,estrus and reproductive disorders in dairy cows.

Cows;milk progesterone;immune biosensors;pregnancy;estrus Corresponding author:ZHANG Hong-you

S823.8

A

0529-6005(2016)02-0022-03

2014-10-22

黑龙江省科技厅攻关项目(GB07B205);黑龙江省农垦总局科技攻关项目(HNK11A-08-01-09和HNKXIV-08-01a)

钱伟东(1990-),男,硕士生,主要从事奶牛营养代谢病研究,E-mail:qwd_900729@163.com

张洪友,E-mail:zhy478@163.com