原癌基因MET启动子的G-四链体结构

阎　敬，关一夫

（中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳110122）

原癌基因MET启动子的G-四链体结构

阎敬，关一夫

（中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳110122）

目的解析原癌基因MET启动子中的G-四链体结构，并初步探索其功能。方法采用圆二色光谱、紫外吸收光谱、非变性凝胶电泳和PCR Stop实验分析MET启动子富含G的Pu23WT序列的G-四链体拓扑结构特征，并分析该结构的功能。结果MET启动子的Pu23WT序列形成了分子内平行型G-四链体结构，该结构能够阻滞聚合酶链反应。结论原癌基因MET启动子形成的分子内G-四链体结构在细胞内K+条件下可能负性调控基因表达。

G-四链体；原癌基因MET；基因表达调控

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人类基因组DNA的主要二级结构是经典的B型双螺旋结构，此外还存在G-四链体、三链体、i-模体等二级结构类型，DNA结构多样性与其功能多样性是密不可分的。上世纪60年代首次报道了某些富含鸟嘌呤（G）的DNA序列能够形成G-四链体结构［1］，它是由4个G通过Hoogsteen氢键形成G-四分体平面，多个G-四分体平面之间由不同的环连接成G-四链体结构，并且平面中心能够容纳一个阳离子。近年的研究陆续发现，在富含G的原癌基因启动子、mRNA的5′非翻译区、核糖体DNA和端粒末端序列等都能够形成G-四链体结构，该结构在基因表达调控过程中发挥着重要的作用。

原癌基因MET位于人类7号染色体长臂（7q31），编码的MET蛋白（也称为肝细胞生长因子受体）具有酪氨酸激酶活性［2］。它的激酶活性可被配体肝细胞生长因子、配体非依赖途径及其他肝细胞生长因子非依赖的受体激活，活化的MET通路通过不同的机制引发一系列磷酸化反应，激活PI-3K、ERK1/2、PLC-γ、STATs、Src和Ras等重要信号通路，从而参与肿瘤的发生、增殖、分化、血管形成、侵袭和转移过程［3］。

生物信息学分析揭示：MET启动子转录起始位点近端区域富含G（启动子-48～-26核酸序列GC GGGCGGGCGGGGCGCTGGGCT，命名为Pu23WT），可能形成G-四链体结构。本研究利用多种生物物理和分子生物学实验方法，详细解析MET启动子的G-四链体结构特点及其在MET基因表达调控中的作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

MET启动子富含G区域的寡核苷酸序列、突变体及引物等由上海生工生物技术有限公司合成；Stains-all购自美国Sigma-Aldrich公司；Klenow Fragment购自大连TaKaRa生物技术公司；UV-Visible分光光度计Cary100购自美国Varian公司；圆二色光谱仪J-810购自日本分光株式会社。

1.2圆二色光谱分析

将MET基因近端启动子-48～-26的Pu23WT序列及其突变体（表1）制备成pH7.4的寡核酸溶液（5 μmol/L寡核酸，140 mmol/L K+，20 mmol/L二甲胂酸钠），然后将该溶液在95℃水浴中变性5 min，缓慢冷却至室温（约25℃），放置过夜；用空白溶液调零后，在0.1 cm样品池中加入500 μL样品，在室温扫描200～350 nm的圆二色光谱，每个样品重复扫描3次。

表1　Pu23WT及其突变体Tab.1 Pu23WT and its mutants

1.3紫外吸收光谱分析

Pu23WT及其突变体样品的准备与采集圆二色光谱的准备方法相同；空白溶液调零后，在比色杯中加入150 μL样品，采集295 nm波长的20～95℃3个循环的吸光度，分别计算变性与复性测量结果的平均值，制作样品的变性、复性和fraction folded曲线，并计算解链温度。

1.4非变性凝胶电泳

将用于圆二色光谱测定的寡核酸样品95℃变性5 min，缓慢冷却至室温（约25℃），然后4℃静置10 min；配制20%非变性聚丙烯酰胺凝胶，4℃缓慢聚合；上样，待样品自然沉降后，在4℃50 V电泳15 min，然后4℃120 V电泳约90 min；室温避光Stains-all溶液中染色过夜，次日曝光约30 min，扫描仪成像。

1.5PCR stop分析

在Pu23WT的3′末端加上9 nt的随机寡核酸（即Pmet序列：GCGGGCGGGCGGGGCGCTGGGC TATGTTCACG），引物（序列：ATCCAGAAGTACGT GAACAT）与Pmet的3′末端互补，在Klenow Fragment的作用下向两端延伸，形成DNA双链结构。如果Pmet序列形成了G-四链体结构，可能抑制Klenow Fragment的聚合作用。分别配制含0 mmol/L、50 mmol/L和140 mmol/L K+的20 μL反应体系，室温反应30 min，加入上样缓冲液终止反应；在室温条件下，15%聚丙烯酰胺凝胶用120 V电压进行电泳70 min；EB染色5 min，凝胶成像仪成像。

2　结果

2.1圆二色光谱和紫外吸收光谱

目前圆二色光谱是最简单、最直接的分析DNA二级结构的常用实验技术，并且圆二色光谱能够区分G-四链体的拓扑学特征，广泛用于研究G-四链体的构型变化。生物信息学分析提示，在MET启动子转录起始位点近端富含G岛的DNA序列中可能形成G-四链体结构，为了解析G-四链体结构的形成、拓扑结构特点及其稳定性，本研究将MET启动子的Pu23WT序列的不同G岛的G逐一突变（表1），然后模拟生理条件检测Pu23WT及其突变体的圆二色光谱（图1）。Pu23G7T与Pu23G10T两个突变体依然保持了与Pu23WT相似的光谱特征：在265 nm附近有正吸收峰，240 nm有负吸收峰，这是平行型G-四链体结构的特征性圆二色光谱；突变体Pu23G1T和Pu23G3T在265 nm附近有一个小的正吸收峰、240 nm的负吸收峰以及290 nm附近的肩峰，提示它们形成了混合型G-四链体结构；Pu23G12/13T则可能形成了平行型G-四链体结构。圆二色光谱的信号强度提示Pu23G7T和Pu23G10T能够形成稳定的G-四链体结构，由此推测Pu23WT序列形成了由3层G-四分体堆积而成的G-四链体结构，即第1个、第2个和第4个G岛以及第3个G岛的5′端或者3′端的3个连续G参与形成了稳定的G-四链体结构。

图1　Pu23WT及其突变体的圆二色光谱Fig.1 CD spectra of Pu23WT and the mutants

利用紫外分光光度计采集295 nm处的Pu23WT及其突变体升温、降温过程的吸收光谱，并比较2个光谱是否拟合。如果完全重合，表明形成的G-四链体是单分子的G-四链体，反之表明这个G-四链体是由多分子形成的。Pu23WT、Pu23G7T与Pu23G10T的升温与降温吸收曲线基本可逆（图2A、2C和2E），说明它们是单分子G-四链体结构。根据升温、降温过程的吸收光谱制作fraction folded曲线，计算得到Pu23WT、Pu23G7T与Pu23G10T的解链温度分别为80.32℃、76.02℃和79.57℃（图2B、2D和2F）。

图2　紫外吸收光谱和fraction folded曲线Fig.2 UV spectra and fraction folded curves

2.2非变性凝胶电泳结果

由于Pu23WT及其突变体形成的G-四链体空间构象不同，分子的紧密程度不同，导致其在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率也不同：分子内的G-四链体结构的迁移率大于单链分子，单链分子的迁移率大于分子间G-四链体结构。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，通过分析样品与分子量标记物的位置关系，推测Pu23WT及其突变体是否形成G-四链体结构以及形成的G-四链体结构是分子内还是分子间构型。在140 mmol/L K+溶液中Pu23WT的迁移率大于25 nt单链分子，说明Pu23WT形成了分子内G-四链体结构；其突变体Pu23G7T和Pu23G10T迁移率更大些，也形成了分子内的G-四链体结构（图3）。

图3　140 mmol/L K+溶液中非变性凝胶电泳结果Fig.3 Non-denatured electrophoresis assay in the buffer of 140 mmol/L K+

2.3PCR stop电泳结果

G-四链体的每个G-四分体平面中心有一个由4个带负电荷的氧原子围成的袋状结构，具有很强的负电性，带正电荷的金属离子或者小分子配体可以与之配位。不同金属离子能够诱导同一DNA序列形成特异拓扑结构的G-四链体，并且金属离子能够提高G-四链体的稳定性。在多种金属离子中，已经证明K+能够稳定G-四链体拓扑结构。在不同浓度的K+溶液中，序列Pmet的Klenow Fragment聚合实验结果显示：无K+的Klenow Fragment体系的扩增效率远高于有K+的扩增体系（图4），说明K+促进Pu23WT形成的G-四链体结构通过空间位阻效应阻滞了Klenow Fragment聚合反应的进行。上述结果显示，MET启动子的Pu23WT序列形成在K+的环境中能够形成分子内平行型G-四链体结构，并且该结构能够阻滞聚合酶链反应。

图4　Pmet的K+浓度依赖的PCR stop实验Fig.4 PCR stop assay results of Pmet in the presence of K+

3　讨论

不同的DNA序列、超螺旋的拓扑结构、离子浓度、DNA结合蛋白和其他修饰［4］可使DNA瞬时形成非B型双螺旋结构，例如Z-DNA、三链体、十字交叉型、发夹、G-四链体和i-模体结构。有研究证明c-MYC［5］、VEGF［6］、HIF-1α［7］、RET［8］、KRAS［9］、BCL-2［10］和c-MYB［11］等多个原癌基因的启动子能够形成G-四链体结构，并且抑制基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，减缓肿瘤细胞侵袭和转移。由此可见，通过诱导原癌基因启动子区域形成G-四链体结构可以抑制基因的表达，进而影响肿瘤细胞的生物学行为。

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（编辑陈姜）

G-quadruplex Structures in promoters of MET proto-oncogene

YAN Jing，GUAN Yifu
（Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

Objective To identify G-quadruplex structures in the promoter region of MET.Methods CD spectroscopy，UV spectroscopy，nondenatured electrophoresis and PCR stop assay were applied to indicate the G-quadruplex structure and its function.Results The Pu23WT sequence in the promoter of MET adopted an intramolecular parallel G-quadruplex structure under physiological conditions in vitro，which can stop the extension of Pmet.Conclusion G-quadruplex structure in the promoter might inhibit MET gene expression in vivo.

G-quadruplex；MET proto-oncogene；regulation of gene expression

R730.53

A

0258-4646（2016）05-0402-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.05.005

国家自然科学基金（31070705）

阎敬（1980-），女，讲师，博士.

关一夫，E-mail：yfguan@mail.cmu.edu.cn

2015-11-27

网络出版时间：