铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶与耐药相关性分析

徐荣，谢，张聪玲，谭为（宜春市人民医院检验科，江西 宜春336000）

铜绿假单胞菌产β-内酰胺酶与耐药相关性分析

目的 调查本院铜绿假单胞菌（PA）耐药性与产β-内酰胺酶现状，并探讨产酶与耐药之间的相关性。方法 收集院内感染PA菌株112株，进行药敏、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、金属β-内酰胺酶（MBL）和头孢菌素酶（AmpC）的检测。构建PA产β-内酰胺酶与耐药之间的Logistic回归方程，ROC曲线评价产酶预期概率（PRE）与多重耐药（MDR）在筛查PA产酶菌株中的价值。结果 我院PA菌株对阿米卡星、美洛培南、亚胺培南、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶的敏感率都＞70%，ESBLs、MBL和持续高产AmpC酶的阳性率分别为3.6%、8%和16.1%。PRE筛查产β-内酰胺酶菌株的灵敏度和特异度可达100%和93%，分别高于MDR的96.2%和74.4%。结论 临床应加强对PA产β-内酰胺酶的监测，以Logistic回归PRE值为指标筛查产β-内酰胺酶菌株，要优于以MDR为指标。

铜绿假单胞菌；β-内酰胺酶；耐药表型；Logistic回归分析

铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa，PA）是非发酵革兰阴性杆菌的代表菌种，广泛存在于医院、社区环境，人体皮肤、肠道、呼吸道中，具有适应性强，毒力因子多的特点，是临床最重要的病原菌之一［1］。在环境选择压力下，PA对各种抗菌药物的耐药率正逐渐升高，出现了大量对β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotic，BLA）广谱耐药的菌株，而BLA由于具有杀菌活性强、毒性低及适应症广的优点，一直是临床抗感染治疗最重要的抗菌药物［2，3］。PA对BLA的耐药机制包括β-内酰胺酶的产生、外膜通透性降低、主动外排泵系统表达，药物作用靶位改变和保护性生物被膜形成等［4］。其中，产β-内酰胺酶机制尤为重要，因为相关基因可通过转座子、整合子、质粒等可移动基因元件在不同菌株之间快速传递，并且这些可移动元件往往又携带有介导其它抗菌药物耐药的因子，容易造成耐药性的广泛播散［5-7］。对临床分离的PA进行主要β-内酰胺酶包括超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum β-lactamases，ESBLs）、金属β-内酰胺酶（Metallo β-lactamase，MBL）和持续高产头孢菌素酶（AmpC）的检测，不仅有利于流行病学重点菌株的监控，还可以为临床合理用药提供指导［8］。现将本院临床分离获得的112株PA产β-内酰胺酶与耐药检测结果及相关性研究报告如下。

1　材料与方法

1.1菌株来源收集本院2014年12月至2105年10月间的临床分离获得的非重复PA菌株112株，标本来源为痰液（90株），伤口分泌物（10株），尿液（6株），穿刺液（3株）和血液（3株）。标准菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853和大肠埃希菌ATCC 25922购自江西省临床检验中心。

1.2仪器和试剂 DRP-9802电热恒温培养箱购自上海森信实验仪器有限公司，DW-HL290超低温冰箱购自中科美菱；药敏纸片哌拉西林（PIP，100μg）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP，100/10μg）、头孢噻肟（CTX，30μg）、头孢他啶（CAZ，30μg）、头孢吡肟（FEP，30μg）、头孢西丁（FOX，30μg）、氨曲南（ATM，30μg）、亚胺培南 （IPM，10μg）、美罗培南（MEM，10μg）、阿米卡星（AMK，30μg）、左氧氟沙星（LVX，5μg）、环丙沙星（CIP，5μg）、阿莫西林/克拉维酸（AMC）和M-H培养基均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3药敏试验根据CLSI 2013版标准，采用纸片扩散法检测PA对PIP、TZP、CAZ、FEP、ATM、IPM、MEM、AMK、LVX和CIP的敏感性，质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.4ESBLs检测［9，10］采用双纸片协同法进行ESBLs检测，在AMC纸片周围20～24mm贴上CTX、CAZ和ATM纸片，如周围任意纸片的抑菌圈在靠近AMC侧出现扩大，则判定为阳性。

1.5MBL检测［7］采用 EDTA纸片增效法进行MBL检测，将0.5mmol/L EDTA溶液10μl分别加到CAZ和IPM纸片上，如CAZ与CAZ-EDTA或IPM与IPM-EDTA之间，任意一对的抑菌环直径相差5mm以上，则判定为阳性。

1.6持续高产AmpC酶检测首先进行粗酶液提取，将待测菌株转接M-H平板过夜培养，刮取1/4平板上的菌苔于1ml无菌生理盐水中，-65℃反复冻融5次（每次冻2h以上，再取出融化）后，4℃、10000r/min离心15min取上清［11］。采用三维试验进行持续高产AmpC酶检测，将0.5麦氏比浊度的大肠埃希菌ATCC 25922涂布于M-H平板上，在平板中央贴一张FOX纸片，从距离纸片5mm处用11号手术刀片向外缘方向切一10×1mm的裂隙，在裂隙中加入40μl酶粗提液。孵育过夜后观察裂隙内侧端有无细菌生长，若在裂隙与FOX纸片交界处出现矢状生长则判断为阳性［10］。

1.7PA产β-内酰胺酶与耐药相关性采用二分类Logistic回归分析，以PA产β-内酰胺酶（ESBLs、AmpC或MBL）为因变量，表型检测中10种抗菌药物的敏感性及MDR判断为自变量。产β-内酰胺酶变量分为阳性和阴性2类，药物敏感性分为敏感（S）和非敏感（R或I）2类，MDR判断分为“YES”和“NO”2类；变量选入方法为基于Wald统计量的前进法，构建回归方程，计算产酶预期概率（Predicted probability，PRE）［12］。以PRE和MDR为检验变量，产β-内酰胺酶为状态变量，绘制ROC曲线。统计软件为SPSS 13.0。

2　结果

2.1药敏试验结果112株PA对10种代表性抗菌药物的敏感性结果见表1，敏感率较高的有AMK （90.2%）、MEM （83%）、IPM （76.8%）、CIP （75.9%）、TZP（72.3%）和CAZ（72.3%）。按多重耐药菌（MDR）国际标准化定义专家建议，PA对抗菌药物中3类或3类以上（每类中1种或1种以上）不敏感则判断为MDR［13］。我院PA的MDR比例为42%（47/112）。MBL和持续高产AmpC的阳性率分别为3.6%（4/ 112）、8%（9/112）和16.1%（18/112），β-内酰胺酶总阳性率为23.2%（26/112），阳性结果见表2。4株菌产MBL同时持续高产AmpC，1株菌产ESBLs同时持续高产AmpC。

表1　112株PA抗菌药物敏感性试验结果

2.3PA产β-内酰胺酶与耐药相关性采用Logistic回归分析构建的方程为PRE=1/［1+e-（3.192MDR+4.176PIP+3.983CAZ+3.132ATM-10.677）］，MDR、PIP、CAZ、ATM 非敏感的相

2.2β-内酰胺酶检测结果112株PA中，ESBLs、对危险度Exp（B）分别为24.3、65.1、53.7、22.9。分别以PRE和MDR为指标诊断PA菌株是否β-内酰胺酶的ROC曲线见图1，PRE曲线的曲线下面积为0.986，要高于MDR曲线的0.853；当PRE取值0.241时，诊断灵敏度和特异度分别为 100%和93%，分别高于MDR的96.2%和74.4%。

3　讨论

本院临床分离获得的112株PA的药敏检测结果显示，AMK、MEM、IPM、CIP、TZP和CAZ的敏感率均大于70%，可作为经验性抗感染治疗的选择；菌株MDR比例为42%，远高于对IPM 23.2%的不敏感率（耐药或中介），因此医院感染控制当中，不能简单以IPM不敏感作为MDR-PA的判断标准。

表2　26株β-内酰胺酶阳性PA检测结果

图1　以PRE和MDR为指标判断PA菌株是否β-内酰胺酶的ROC曲线

β-内酰胺酶按Ambler分类可分为A～D类［14］。ESBLs属于A类或D类，能灭活广谱头孢菌素和单环β-内酰胺类，可被克拉维酸抑制，主要存在于肠杆菌科细菌。本院PA产ESBLs比例较低，为3.6%，3株单产ESBLs菌株都表现为对复合制剂TZP敏感。MBL属于B类，能灭活包括碳青霉烯类在内的多数BLA，可被EDTA抑制。本院PA产MBL的比例为8%，9株MBL阳性菌株中有2株对ATM敏感，可能与MBL对单环β-内酰胺类水解能力低有关［1，11］。AmpC酶属于C类，为PA染色体固有，当染色体基因变异或质粒介导时可持续高产，本院PA持续高产AmpC酶比例为16.1%，在三类主要β-内酰胺酶中阳性率最高。

本实验中选择的ESBLs、持续高产AmpC酶和MBL检测方法，所用材料在一般临床微生物室都常备或较易获取，但与改良三维试验一样较耗费精力，日常工作中很难对临床分离的所有PA菌株都进行检测，因此有必要先对可能产β-内酰胺酶的菌株进行筛查［11］。针对本院112株PA菌株的检测结果显示，单纯以MDR阳性为产酶筛选标准，灵敏度和特异度分别为96.2%和74.4%，如果采用二分类Logistic回归分析综合耐药表型为PRE值后，再进行判断，灵敏度和特异度可达100%和93%。

Logistic回归分析显示，在10种代表性抗菌药物中，只有BLA中的PIP、CAZ和ATM耐药可作为PA菌株产β-内酰胺酶的高危因素，相对危险度Exp（B）分别为65.1、53.7和22.9。没有被纳入方程的自变量（P＞0.05）包括IPM和MEM，可能的原因是，很多不产β-内酰胺酶PA菌株存在着对碳青霉烯类抗生素耐药的其它机制，如Opr D2蛋白缺失等［15，16］。

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Correlation analysis between β-lactamases of Pseudomonas aeruginosa and drug resistance

XU Rong，XIE Jing，ZHANG Congling，et al.People's Hospital of Yichun City，Yichun Jiangxi 330006，China.

Objective To investigate the status of drug resistance and β-lactamases of Pseudomonas aeruginosa（PA）in our hospital，and explore the correlation between them.Methods 112 strains of hospital-acquired PA were collected.Their drug-resistant phenotypes were tested by K-B method and β-lactamases，including ESBLs，MBL and AmpC，were also detected.Then the Logistic regression equation between drug resistance and β-lactamase was build to calculate predicted probability（PRE）.ROC curve was used to evaluate the value of PRE and MDR index.Results The sensitive rates of AMK，MEM，IPM，CIP，TZP and CAZ were higher then 70%，and the positive rates of ESBLs，MBL and AMPC were 3.6%、8%and 16.1%respectively in our hospital. For screening of β-lactamase positive PA，the sensitivity and specificity of PRE index was 100%and 93%，which were higher than those of MDR index.Conclusion The clinical monitoring of PA β-lactamases should be strengthened.PRE from Logistic regression may be a better index than MDR for the screening of high-risk strains.

Pseudomonas aeruginosa；β-lactamase；Drug-resistant phenotype；Logistic regression

R446.5，Q939.92，R378.99+1

A

1674-1129（2016）04-0451-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.013

徐荣，男，1985年1月生，硕士，主管技师，主要从事临床微生物学检验及研究工作。

（2016-03-09；

2016-07-10）