液基夹层杯技术检测支气管肺泡灌洗液中抗酸杆菌对菌阴肺结核的诊断价值

成松，刘成永，张雪迪，侯远沛，周冬青，闫家微，魏素梅，秦艳秋

（1、徐州市传染病医院检验科，江苏 徐州221004；2、徐州市传染病医院院感科，江苏 徐州221004）

液基夹层杯技术检测支气管肺泡灌洗液中抗酸杆菌对菌阴肺结核的诊断价值

成松1，刘成永1，张雪迪1，侯远沛1，周冬青1，闫家微1，魏素梅1，秦艳秋2△

（1、徐州市传染病医院检验科，江苏 徐州221004；2、徐州市传染病医院院感科，江苏 徐州221004）

目的 评估利用液基夹层杯离心涂片集菌技术检测支气管肺泡灌洗液中抗酸杆菌对菌阴肺结核的临床诊断价值。方法 选取我院收治的106例菌阴肺结核患者，所有患者均进行支气管肺泡灌洗液液基夹层杯离心涂片集菌法，荧光定量PCR（FQ-PCR）法，罗氏培养进行抗酸杆菌检测。并通过与罗氏培养法的比较分析液基夹层杯离心涂片集菌法的灵敏度、特异度及临床应用价值。结果 罗氏培养法和液基夹层杯离心涂片集菌法对临床确诊的菌阴肺结核患者支气管肺泡灌洗液抗酸杆菌检出率分别为66.0%，70.7%，两者的阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=1.231，P=0.267，P＞0.05）。结论 液基夹层杯离心涂片集菌法检测支气管肺泡灌洗液抗酸杆菌，具有快速、敏感度和特异度较高的优点，对肺结核具有较高的诊断价值，为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。

支气管肺泡灌洗液；液基夹层杯检测法；抗酸杆菌；肺结核

肺结核是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的全球流行的主要传染病［1］，病原学检查是结核病的诊断和制定化疗方案的重要依据［2］。我国结核病患者患病率为459/10万，而其中，菌阳患者119/10万，涂阳患者是66/10万［3］。由于检测方法、患者因素、痰液质量以及检测者的业务能力等问题，存在大量的痰菌阴性肺结核病患者［4］。痰菌阴性肺结核是指影像学资料或者胸片提示有结核的特征，但一次痰结核菌培养为阴性，三次痰涂片也为阴性的结核患者。在我国菌阴结核患者占肺结核患者总数的70%左右［5］，如何提高这类患者的病原学检出率，并有效而快速地作出早期的诊断，已经成为临床工作者比较关注的重点之一［6，7］。支气管肺泡灌洗液（以下简称BALF）是利用纤维支气管镜，对肺段和亚肺段进行灌洗后，采集的肺泡表面衬液。BALF对于一些不容易留取或者是不会咳痰的患者来说是一种有效提高病原体检出率的方法，而且BALF更接近于病灶也能提高其检出率［8］。因此，我们对液基夹层杯法检测技术测定肺泡灌洗液中抗酸杆菌在肺结核的诊断价值进行了临床观察。现报告如下。

1　资料和方法

1.1资料来源选择2015年1月至2015年12月收住我院结核科确诊的菌阴肺结核患者118例，其中106例成功行支气管肺泡灌洗液检查，作为实验组。对照组来自徐州市中心医院呼吸科，其中肺炎、支气管扩张、大叶性肺炎、间质性肺炎和肺癌患者22例，其中男13例，女9例，男女比例1.44：1，平均年龄48.9±17.4。实验组中男64例，女42例，男女比例1.52：1，平均年龄44.7±16.7。年龄与性别基线水平具有可比性（P＞0.05）。本研究通过徐州市传染病医院伦理委员会批准 （批件号：2015 年XC审第16号）并取得患者的知情同意。

1.2材料上述患者的BALF标本采集方法如下：根据患者的胸片或者是CT资料，选择支气管飞段病变部位作为灌洗的位置；然后将生理盐水10～25ml通过纤支镜灌入支气管肺段的相应部位，然后通过负压 （压力为 25～100mmHg；1mmHg= 0.133kPa）吸引BALF至瓶中，此操作可以重复灌洗2-3次，收集BALF15～20ml左右，送检验科检测。

1.3实验仪器和试剂液基夹层杯离心涂片集菌试剂由湖南天骑公司提供，包括振荡器，恒温干片机，离心涂片机，高速离心机等。罗氏培养基购于贝索公司；PCR扩增仪器采用西安天隆TL-988型FQ-PCR仪，试剂盒试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.4统计学方法采用PEMS 3.0统计软件进行统计学分析。以罗氏培养法结果作为金标准，计算液基夹层杯法的敏感度、特异度、和约登指数。液基夹层杯法和罗氏培养法等的阳性检出率比较采用χ2检验。

2　结果

2.1实验组BALF检测情况中液基夹层杯离心集菌法分别与罗氏培养法和荧光定量PCR法相比无统计学意义，χ2=1.231，P=0.267，P＞0.05；χ2=1.714，P=0.189，P＞0.05。详见表1。

2.2以罗氏培养法作为标准，那么液基夹层杯离心集菌法的灵敏度、特异度、和约登指数分别为94.3%，87.1%，0.814。详见表2，表3。

3　讨论

据报道，肺结核患者中，2/3以上为菌阴型［9］，临床上根据患者的临床症状和胸片以及影像学资料来诊断结核，容易造成患者的漏诊和误诊，对于结核病的控制不利。并且痰涂片抗酸杆菌阴性的病人并不意味着痰液中无结核杆菌，这与患者留取痰液标本的质量，排菌量的多少，病情严重的程度，方法的局限性以及实验人员的检测水平等有关，其影响因素较多，从而导致了一部分排菌患者被错误地诊断为菌阴［10］。据报道，接触菌阴性肺结核患者被感染的几率大概为7.3%～21.0%［11］。痰培养是诊断结核的金标准，但是结核菌的培养所需要的时间较长，一般在4～8周左右；所以，如何快速高效地发现传染源，提高对结核分枝杆菌的检出率，对患者的疾病预防和治疗都有重要的价值。

表1　三种检测方法对BALF中结核分枝杆菌的检出结果

表2　液基夹层杯离心集菌法与罗氏培养法结果对比

表3　液基夹层杯离心集菌法与荧光定量PCR法结果对比

近年来，纤维支气管镜检查技术的广泛应用，为临床提供了一种更高效的检测手段，对结核病患者的诊断具有重要的临床价值，因为纤维支气管镜检查直接取材于病变部位，其中的菌量浓度高，获得结核分枝杆菌的机会增多，而且经纤维支气管镜检查获得的支气管肺泡灌洗液污染率低，对于一些无痰患者也可以检测。据有关文献报道［12］，以罗氏培养法作为金标准液基夹层杯离心集菌法对痰液抗酸杆菌检测的灵敏度高于直接涂片法［13］。这也在一定程度上说明了液基夹层杯离心集菌法提高了对结核病患者的发现率，对结核病治疗和预防有着重要的临床意义。

液基夹层杯离心集菌法是对直接涂片法进行改良和创新的基础上形成的，该技术主要原理为经过消化灭活液消化后的标本通过滤过式夹层杯过滤，将抗酸杆菌阻拦在纳米硅介质微孔滤膜膜片上，直接染色。取出膜片置于滴有光媒介液体的阅片夹中可以直接通过普通显微镜进行观察。液基夹层杯离心集菌法不仅具有检出的阳性率高，生物安全性高，操作的标准化程度高，以及可以批量处理标本等优点；而且还保留了直接涂片直观，快速的特点；此技术的主要创新点表现在标本的消化处理和高速离心集菌以及批量处理标本这几个方面，其作用主要表现在以下三个方面：一是批量处理标本；二是此种方法提供的消化液能彻底消化标本中的黏蛋白，能很好的释放菌体；三是灭活结核分枝杆菌，保障后期操作步骤的生物安全，后面的操作步骤就是通过高温加热，然后高速离心，将释放出的已经灭活的菌体集聚到彭氏夹层杯底部的基片上，然后再通过染色，镜检；其步骤与直接涂片法大体一致。基于以上创新点，液基夹层杯离心集菌法具有生物安全性高和检出阳性率高的特点［14］，因此本研究采用液基夹层杯离心集菌技术检测支气管肺泡灌洗液中的抗酸杆菌。

本实验通过对BALF中抗酸杆菌用液基夹层杯离心集菌法、罗氏培养法、以及荧光定量PCR法检测的比较，三种方法的阳性率分别为70.7%，66.0%，77.4%。液基夹层杯离心集菌法的阳性率高于罗氏培养法，但无统计学意义；且虽低于荧光定量PCR法但也无统计学意义，因此液基夹层杯离心集菌法与罗氏培养法和荧光定量PCR法有良好的一致性。以罗氏培养法为标准，液基夹层杯离心集菌法的特异度，灵敏度、和约登指数分别为87.1%，94.3%，0.814，因此有较好的检测能力和准确性。罗氏培养法与液基夹层杯离心集菌法和荧光定量PCR法不相符标本的情况分析：液基夹层杯离心集菌法阳性而罗氏培养法阴性9例中，经荧光定量PCR法检测阳性7例，可能原因是死菌。液基夹层杯离心集菌法阴性而荧光定量PCR法阳性7例，经罗氏培养3例阳性4例阴性。液基夹层杯离心集菌法也存在缺点，就是其不能正确的区分是活菌还是死菌；这也在一定程度上造成了与罗氏培养法不相符合的结果，这也有待于临床医生通过其他的检测方法来分析判断［15］。

综上所述，在结核病防治的严峻形势下，早期诊断已成为控制结核病传染的关键因素［16］，而液基夹层杯技术提高了肺结核病人的标本阳性检出率，且操作简单，安全性高［17］，所以液基夹层杯技术检测支气管肺泡灌洗液中的抗酸杆菌在实验室用于结核病的诊断具有很大的推广价值。

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Detection of acid-fast bacillus with liquid-based interlayer vessel technique in brocho-alveolar lavage fluid to assess the diagnostic value of sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis

CHENG Song，LIU Chengyong，ZHANG Xuedi，HOU Yuanpei，ZHOU Dongqing，YAN Jiawei，WEI sumei，QIN yanqiu.1.Department of Clinical laboratory，Xuzhou infectious diseases hospital，Xuzhou，Jiangsu；2.The infection-control Department of XuZhou infectious disease hospital，xuzhou，Jiangsu，221004，china.

Objective To assess the diagnostic value of sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis with detection of acid-fast bacillus in brocho-alveolar lavage fluid（BALF）by liquid-based interlayer vessel technique.Methods Selecting 106 cases of hospitalized patients with sputum bacterium negative tuberculosis，the methods of liquid-based interlayer vessel technique，fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR）and L-J culture were used to detect mycobacterium tuberculosis in BALF derived from all patients.the sensitivity，specificity and clinical application value of liquid-based interlayer vessel technique were evaluated by comparing with the L-J culture method.Results The detection rate of acid-fast bacillus with L-J culture method and liquid-based interlayer vessel technique was 66.0%，70.7%respectively in BALF derived from patients with sputum bacterium negative pulmonary tuberculosis，there was no significant difference in the positive rate detected by the two methods（chi-square=1.231，P=1.231，P＞0.05）.Conclusion liquid-based interlayer vessel technique has the advantages of faster，more sensitive and specific，and it has high value in the diagnosis of pulmonary tuberculosis and provide a good basis for the diagnosis of patients with sputum smear negative and patients without sputum.

Brocho-alveolar lavage fluid；Liquid-based interlayer vessel technique；Acid-fast bacillus；Pulmonary tuberculosis

R378.91，R521

A

1674-1129（2016）04-0428-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.04.006

成松，男，1982年11月出生，本科，主管检验师，主要从事结核病的细菌，免疫，分子生物学工作。

秦艳秋，女，1972年12月生，本科，副主任护师，主要从事生物安全防护及医院感染工作。E-mail:95235544@qq.com，

（2016-04-01；

2016-06-20）