耐核苷（酸）类药物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P区耐药突变位点分析*

谢巧灵，丛庆伟，吴凌虹，朱　英

·肝硬化·

耐核苷（酸）类药物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P区耐药突变位点分析*

谢巧灵，丛庆伟，吴凌虹，朱英

目的了解慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布和P区耐药突变位点的变异模式。方法选择39例经核苷（酸）类似物（NAs）治疗后存在耐药或疑似耐药的慢性乙型肝炎和肝硬化患者为研究对象，采用实时荧光定量PCR法测定血清HBV DNA，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定和回收纯化后，交由上海生工生物工程（北京）有限公司进行测序，与HBVseq数据库比对，观察HBV基因型分布和耐药位点变化情况。结果34例（87.2%）患者能检出HBV基因型，其中C基因型有32例（82.1%），B基因型有2例（5.1%）；27例（69.2%）患者存在RT区序列突变，其中点变异12例（30.8%），rtM204I/V/S、rtA181V/T、rtI169T突变分别占15.4%、5.1%、10.3%，组合变异15例（38.4%）；23例患者存在对NAs耐药，其中8例患者对阿德福韦酯耐药（1例为B基因型，7例为C基因型），耐药位点为rtA181V/T/S、rtV214A/E和rtN236T；11例患者对拉米夫定和替比夫定同时耐药，均为C基因型，其共同耐药位点为rtM204I/V/S和rtL180M；3例患者存在对LAM、LDT和恩替卡韦同时耐药，均为C基因型；1例C基因型患者对LAM、LDT和ADV同时耐药，其变异模式为rtM204I/V/S＋rtA181V/T/S＋rtL180M。结论多数对NAs耐药患者可在HBV P区检出基因突变，且突变形式多样，其中以rtM204I/V/S突变为主，不同核苷（酸）类似物中存在共同耐药位点。

乙型肝炎；HBV基因型；核苷（酸）类似物；突变

【Abstract】ObjectiveTo investigate the distribution characteristics of hepatitis B virus genotypes in patients with CHB or hepatitis B cirrhosis，and to explore the mutants patterns in HBV P gene sequences during nucleos（t）ide analogue（NAs）treatment.Methods39 patients with CHB or hepatitis B cirrhosis observed drug resistance or suspected drug resistance were enrolled.Serum HBV DNA levels was detected by real time PCR，and then sequenced and compared with standard sequence in HBVseq datebase.ResultsThe genotypes of HBV in 34（87.2%）patients were observed，and the genotype C was found in 32（82.1%），and genotype B in 2（5.1%）. 27（69.2%）of 39 patients were observed carrying mutation in RT gene sequence;point mutations accounted for 30.8%，including 6 harboring rtM204I/V/（15.4%），2 harboring rtA181V/T（5.1%），and 4 harboring rtI169T（10.3%），and combination mutations were 38.4%;there were 23 patients detected to be resistant to NAs.8 patients were resistant to adefovir dipivoxil（ADV），and among them，one was genotype B，and the other 7 were genotype C，harboring rtA181V/T/S，rtV214A/E or rtN236T；11 patients were resistant to both lamivudine（LAM）and telbivudine（LDT）with genotype C，harboring rtM204I/V/S or rtL180M；3 patients were resistant to LAM，LDT and entecavir（ETV），and they were all with genotype C；1 patient with type C was resistant to LAM，LDT and ADV，and the mutation pattern was rtM204I/V/S+rtA181V/T/S+rtL180M.ConclusionHBV P mutations exist in most patients with chronic hepatitis B；the rtM204I/V/S mutations is the dominate mutation pattern，and different NAs may share the common mutations.

【Key words】Hepatitis B；HBV genotypes；Nucleos（t）ide analogues；Mutation

与乙型肝炎相关的肝脏疾病仍然是全球人类健康的重要威胁。目前约有3.5亿人为慢性HBV感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌[1]。抗病毒治疗仍然是有效的治疗乙型肝炎，预防和延缓肝硬化和肝癌发生的有效方法[2～4]。由于核苷（酸）类似物[Nucleos（t）ide analogues，NAs]相对于干扰素类具有强效的抑制病毒复制、用法方便、副作用少等特点常作为大部分病人优先选择的治疗方案[5～7]。然而，耐药一直是选择NAs抗病毒治疗不可回避的问题，并且随着治疗时间的延长，耐药率逐年上升。本文通过对39例慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者感染HBV基因型及P区耐药突变位点的检测，旨在研究HBV基因型分布及耐药基因突变的特点，为临床病情分析及选择治疗药物提供理论依据。

1　资料与方法

1.1病例来源选取2013年3月至10月就诊于我科的慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者39例，男性29例，女性10例；年龄27～66岁，平均年龄（49±9.9）岁。符合2010年发布的慢性乙型肝炎防治指南中慢性乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化的诊断标准[8]，其中慢性乙型肝炎患者31例（79.5%），肝硬化患者8例（20.5%）。所有纳入患者均经过拉米夫定（Lamivudine，LAM）、阿德福韦酯（Adefovir dipivoxil，ADV）、替比夫定（Telbivudine，LDT）、恩替卡韦（Entecavir，ETV）或者替诺福韦（Tenofovir，

TDF）单独或联合治疗半年以上，因出现病毒学突破或反复肝功能异常而被临床认定为耐药或疑似耐药。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒、柯萨奇病毒、EB病毒等其他非嗜肝病毒感染以及药物性肝损伤、酒精性肝病、自身免疫性肝病。

1.2仪器和试剂LightCycle R 96实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司；血清HBV DNA检测试剂盒购于深圳凯杰生物有限公司。

1.3血清HBV DNA提取和扩增对符合纳入标准的患者采集肘静脉血5 ml，留取血清，-30℃集中保存，使用前于室温下溶解。取血清50 μl，加入裂解液50 μl，100℃保温10 mins，13000 r/m离心5 mins。使用Lightcycle荧光PCR扩增仪进行HBV DNA扩增，设定反应条件：93℃，2 min，然后，93℃，30 s，55℃，45 s，循环40次。

1.4 DNA测序将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定和回收纯化后，交由上海生工生物工程（北京）有限公司进行测序。

1.5 RT区基因突变分析将测序所得的核苷酸序列与HBVseq数据库中序列[9]比对，主要对rt204、rt181、rt236耐药位点进行分析。同时对rt173、rt 180、rt207、rt213、rt214、rt215、rt236、rt237、rt238、rt18 4、rt202、rt250等次级耐药位点及补偿耐药位点进行分析，得到相应变异位点和基因分型结果。

2　结果

2.1基因分型情况在39例患者中，34例（87.2%）能检测出基因型，其中C基因型32例（82.1%），B基因型2例（5.1%）。5例（12.8%）因病毒载量低，无法进行基因分析及耐药位点检测，未检测到A、D、E、F基因型。

2.2基因型与耐药位点分析在39例患者中，发现27例（69.2%）存在HBV RT区序列突变，12例（30.8%）未检测到HBV RT区序列变异。C基因型26例（66.7%），B基因型1例（2.6%）；点变异12例（30.8%），组合变异15例（38.4%）。39例患者RT区序列突变情况见表1。

表1　 39例乙型肝炎和肝硬化患者HBV RT区序列突变情况

2.3核苷酸类似物应用与耐药位点分析检测到8例患者对ADV耐药，其中1例为B基因型，其余为C基因型。耐药位点分别为：rtA181V/T/S、rtV214A/ E、rtN236T，变异模式为rtA181V/T/S或rtN236T单位点变异和rtA181V/T/S+rtN236T、rtA181V/T/S+ rtV214A/E、rtA181V/T/S+rtV214A/E+rtN236T联合变异；其中rtA181V/T/S和rtN236T为主要耐药位点，rtV214A/E为可能耐药位点；11例患者对LAM耐药，均为C基因型，发现对LAM耐药的患者都对LDT耐药，其共同主要耐药位点为rtM204I/V/S，代偿耐药位点为rtL180M；3例患者存在LAM、LDT、ETV共同耐药，均为C基因型；ETV耐药位点为rtL180M、rtM204I/V/S、rtT184S/A/G/I/L、rtI169T、rtM 250V/I/L，其中rtL180M、rtM204I/V/S为LAM和LDT共同耐药位点；1例C基因型患者对LAM、ADV、LDT同时耐药，其变异模式为rtM204I/V/S+ rtA181V/T/S和+rtL180M。rtA181V/T/S和rtV214A/ E是ADV主要的耐药位点，而rtA181V/T/S和rtV214A/E可能是LAM潜在的耐药位点。未发现对TDF耐药患者。

3　讨论

HBV基因组由不完全的环状双链DNA组成，有S区、C区、P区和X区4个开放阅读框，均位于长链，其中P区是最长的读码框，编码多种功能蛋白，包括DNA聚合酶[10]。此酶既有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能。目前，NAs均以HBV逆转录酶作为靶点，通过取代病毒复制过程中延长聚合酶链所需的结构相似的核苷，发挥抑制病毒复制的作用。所以，NAs并不能清除肝细胞内的HBV cccDNA，需要长期服用才能获得持久的病毒学、生化学以及血清学应答。在持久的药物选择压力作用下，催生了耐药的发生。当然，NAs选择出变异株的可能性主要取决于其抑制病毒复制的强度，即越能强效的抑制病毒复制，其耐药的概率越小。本研究总结了39例慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布特点和不同种类NAs的耐药变异模式。

1988年，日本学者Okamoto根据HBV DNA全基因序列异质性≥8%的标准首次提出HBV基因型的概念，并通过比较18珠不同的血清HBV DNA全序列，将HBV分为A、B、C、D基因型[11]。至今HBV可分为A～J 10种基因型[12]。HBV基因型具有明显的地理分布特点，在东亚地区如中国、韩国、日本，慢性乙型肝炎患者以B型和C型为主。我国南方以B型多见，北方以C型为主，少数民族地区可见到一定比例的A型和D型。周莉等报道在北京地区297例CHB患者中，B型占12.18%，C型占87.21%，未发现其它基因型[13]。本研究发现的乙型肝炎和肝硬化患者感染HBV基因型分布特点与上述结论基本一致。

既往报道表明，HBV基因型不仅与临床转归有关，与不同类型的药物治疗效果也有关系。B基因型患者临床病变多较轻，C基因型往往与较重的病情有关[14，15]。李洁萍报道了C基因型引起的肝组织炎症坏死及肝纤维化的进展程度较B基因型明显加重，有显著的统计学差异（x2=8.82、x2=10.67，均P＜0.05）[16]。研究表明B基因型对干扰素治疗应答效果较C基因型好，而B、C两种基因型对NAs的治疗应答效果无明显差异。对于基因型与HBV耐药检出率的相关性，目前的报道并不一致。林菲等报道在153例CHB患者，B、C基因型耐药检出率无统计学差异[17]；闵晓春等研究的结果显示基因B型比基因C型更易检出耐药位点[18]。本研究中，在32例（82.1%）C基因型和2例（5.1%）B基因型患者，检测到27例RT区序列突变，只有1例（6.6%）是B基因型感染者，其余耐药患者均为C基因型，可以看出检出的耐药患者C基因型所占比例更大，与之前报道不一致，也许与本研究纳入对象均为临床疑似耐药或者观察到耐药的患者，且样本量较小有关。

由于NAs在抗病毒过程中具有疗程不确切的特点，随着治疗时间的延长，NAs耐药不可避免。目前已经发现LAM耐药相关位点为rtM204I/V/S、rtA181V/T/S、rtV173L、rtL180M，其中M204V/I/S（YMDD变异及酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸区域）位点被称为主要耐药突变，它的出现显著地降低了病毒对LAM的敏感性，其他的变异常与YMDD变异同时出现，一定程度上能够恢复YMDD变异病毒的复制能力[19]。LDT主要耐药位点为：rtM204I/V/S，代偿耐药位点是rtV173L和rtL180M，LDT和LAM具有相同的耐药位点，即rtM204I/V/S。因此，对LAM耐药的患者往往对LDT有交叉耐药。在本研究中发现11例LAM耐药患者都对LDT耐药，变异模式为rtM204I/V/S单位点或者rtM204I/V/S+rtL180M组合变异，支持既往的研究结论。同属于核苷类似物的ETV主要耐药位点为rtL180M、rtM204I/V/S、rtI169T、rtT184S/A/G/I/L、rtS202G/C/I、rtM250V/I/L，在本研究中共检测到rtL180M、rtM204I/V/S、rtI169T、rtT184S/A/G/I/L位点变异，均为组合变异模式，3例ETV耐药患者对LAM、LDT同时耐药，说明NAs之间存在交叉耐药，在LAM耐药基础上出现的ETV耐药称为二次打击模式[20]，提示当核苷类似物中出现变异时应换用或者加用无环核苷酸类类似物。ADV存在rtA181V/T/S、rtN236T主要耐药位点，rtV214A/E、rtQ215S、rtI233V、rtP237H、rtN/H238T/D可能耐药位点。本文中检测到的ADV耐药变异模式为rtA181V/T/S或rtN236T单位点变异及rtA181 V/T/S+rtN236T、rtA181V/T/S+rtV214A/E、rtA181V/T/ S+rtV214A/E+rtN236T组合变异。当患者耐药位点为rtA181V/T/S时，研究发现其对LAM敏感性降低，说明LAM与ADV可能存在交叉耐药。TDF的耐药位点为rtA194T。本研究中未检测到TDF耐药。目前未发现ETV与ADV有共同耐药位点。当出现任何一种NAs耐药时，都可以换用ADV联合ETV抗病毒。本研究未发现TDF与其他NAs存在共同耐药位点，TDF仍可作为耐药后的补救选择。但是，TDF对ADV耐药患者的治疗效果仍然值得关注。

由于NAs仍然是大部分CHB患者首选的治疗方案，耐药变异是每一个临床医生及病人都必须正视的问题。根据目前的研究已经明确了NAs药物的部分耐药位点，在治疗基线时检测患者HBV耐药位点可能会取得更好的抗病毒效果，并节约卫生经济资源，但是需要注意的是肝细胞内的HBV具有很高的复制率，且HBV聚合酶缺乏校正功能，治疗开始时根据耐药位点选择的抗病毒药物仍然有可能再产生新的变异。因此，在治疗基线时检测患者HBV耐药位点并不能取得一劳永逸的效果。随着新的抗病毒药物的面世，新的耐药位点将不断涌现，更大样本、更全新的研究抗病毒药物的耐药仍然是必须的。

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（收稿：2015-04-17）

（本文编辑：陈从新）

HBV genotypes and P gene resistant mutants in hepatitis B patients duringnucleos（t）ide analogues

Xie Qiaoling，Cong Qingwei，Wu Linghong，et al.Department of Infectious Diseases.First Affiliated Hospital，
Dalian Medical University，Dalian 116000，Liaoning Province，China

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.01.015treatment

国家自然科学基金资助项目（编号：81273925）

116000辽宁省大连市大连医科大学附属第一医院感染病科第一作者：谢巧灵，女，24岁，硕士研究生。E-mail：13354282583@163.com

朱英，E-mail：zhuyingsh52@126.com