一种稳定的人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术

李鹏昊，曲　婷，黄继华，韩婷婷，温子娜，崔淑艳，钟　影

一种稳定的人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术

李鹏昊，曲婷，黄继华，韩婷婷，温子娜，崔淑艳，钟影*

（成都市锦欣生殖医学与遗传学研究所，成都市锦江区妇幼保健院，四川成都610066）

目的： 建立一种稳定、简便的人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术，为揭示母方减数分裂错误及其发生原因、探讨非整倍性发生机制、评价外环境因素对人卵母细胞的遗传学效应提供有力工具。方法：经签订知情同意书后，取体外受精术后废弃的人卵母细胞，经低渗、渐进固定处理、制备人卵母细胞染色体核型。应用人16号染色体着丝粒荧光探针，经变性处理后与人卵母细胞核型进行荧光原位杂交，再经洗脱和染色等步骤，在荧光显微镜下分析。结果：经过上百批次重复实验，人卵母细胞染色体形态与分散良好，荧光信号明亮清晰、背景干净。结论：成功建立人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术。

人卵母细胞；染色体；荧光原位杂交；减数分裂错误；非整倍性

【ABSTRACT】OBJECTIVE: In humans，aneuploidies occur in at least 5% of all clinically recognized pregnancies，among which about 90% can be caused by maternal meiotic error. In this study，a stable and simple method for fluorescence in situ hybridization (FISH) with human oocyte chromosomes was developed to explore causes of maternal meiotic error，mechanisms of aneuploidy and genetic effects of environmental factors on human oocytes. METHODS：The abandoned human oocytes were collected from IVF patients who signed consent forms. The oocytes were used to prepare chromosomal karyotype through hypotonic and gradual fixative treatments. Human oocyte metaphase FISH was performed using the CEP 16 Probe. RESULTS：From our observations，the morphology and dispersal of human oocyte chromosomes were excellent，and the fluorescence signals were bright and clear with clean background. CONCLUSION：We established successfully the method for FISH with human oocyte chromosomes.

【KEY WORDS】human oocyte；chromosome；fluorescence in situ hybridization；meiosis error；aneuploidy

人类精、卵的细胞遗传学研究具有重大意义，因为精、卵的任何染色体异常都会对下一代造成严重后果。自1978年Rudak建立人精子染色体制备技术以来[1]，人精细胞遗传学研究发展很快，而人卵细胞遗传学研究由于实验材料获得困难，进展非常缓慢。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是利用荧光标记探针与染色体上的靶DNA序列杂交，通过检测荧光信号，从而对目的片段进行定性、定量或相对定位的分子细胞遗传学技术，具有特异性强、敏感率高、检测时间短、直观性好等优点，将其与人卵母细胞染色体制备技术相结合，检测人卵母细胞染色体异常，具有广阔的应用前景[2]。人类辅助生殖技术的成功为科学家们获得人卵母细胞用于实验研究提供了可能。近些年来，国外学者利用体外受精(in vitro fertilization，IVF)术后废弃的人卵母细胞进行了染色体核型分析[3]，国内虽有个别文献报道卵母细胞FISH，但仅对卵母细胞间期核或极体而言，应用人卵母细胞染色体FISH进行核型分析迄今未见报道。我们建立了一种稳定、简便的人卵母细胞染色体FISH技术，为揭示母方减数分裂错误及其发生原因、探讨非整倍性发生机制、评价外环境因素对人卵母细胞的遗传学效应提供了有力工具。

1　材料与方法

1.1卵母细胞和荧光探针

临床上废弃的人卵母细胞来自2013年10月—2015年7月因不育不孕到成都市锦江区妇幼保健院进行IVF的术后部分患者，经患者知情同意书后用于实验。人16号染色体着丝粒探针(CEP16)购自美国Vysis公司。

1.2主要仪器和试剂

1.2.1主要仪器原位杂交仪(Thermobrite-S500)购自美国雅培公司。

1.2.2卵母细胞洗涤液实验当天配制，取按表1配制的Biggers-Whitten-Whittingham (BWW)培养基70 mL加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 210 mg配制成含0.3% BSA的培养基用于卵母细胞洗涤。

表1　BWW培养基

1.2.3低渗液和固定液实验当天配制，取0.068 mol/L的KCl溶液30 mL加入BSA 30 mg配制成含0.1% BSA的低渗液。取甲醇∶冰醋酸∶蒸馏水按如下体积比例配制成固定液I(5∶1∶2.5)、固定液II(3∶1∶0)和固定液III(3∶3∶1)。

1.2.4原位杂交用缓冲液和洗涤液取20×柠檬酸钠盐溶液(saline sodium citrate，SSC)100 mL加入850 mL纯水，用NaOH调pH值至6.8～7.2，加纯水至1 L制备成原位杂交用缓冲液。取100 mL 20×SSC、850 mL ddH2O和1 mL Nonidet P-40 (NP-40)，室温下混匀溶解，用NaOH调pH值至6.8～7.2，加纯水至1 L制备成原位杂交用洗涤液。两种溶液室温保存，超过6个月、出现沉淀或者污染弃用。

1.3方法

1.3.1人卵母细胞染色体制片将卵母细胞加入盛有低渗液的凹玻板孔底部，低渗处理5～8 min。吸取卵母细胞放入盛有固定液I的凹玻板孔底部，此时卵母细胞变成棕褐色；随着固定时间的延长，颜色逐渐变浅；固定至5～7 min时，将卵母细胞吸移至载玻片上标记圆圈的中心；吸取固定液II，用其挥发的气体在卵母细胞上方薰蒸，再将吸管头退至圆圈边缘，缓慢释出固定液II，覆盖载玻片上所有卵母细胞，将载片放入固定液II中固定至少5 min；再在固定液III中固定1 min，用温湿蒸气将样本吹干。继后将样本在70%、85%、100%乙醇中各处理2 min脱水；在65 ℃烤箱中处理15～30 min使制片老化；制片可立即用于FISH，或在低温冰箱中保存备用。

1.3.2荧光原位杂交在原位杂交仪上设置程序为：83 ℃变性5 min；37 ℃杂交16 h。在200 μL微量离心管中加入Buffer 7 μL，ddH2O 2 μL，探针1 μL，离心1～3 s；将充分混匀的探针变性溶液加在靶染色体区域，覆以盖玻片，去气泡后用封片胶密封，放入杂交仪进行变性与杂交过夜。从原位杂交仪中取出制片，在室温下于2×SSC溶液中去除封口胶和盖片；将其放入预温至46 ℃的2×SSC中，洗涤10 min；转入预温至46 ℃的2×SSC/0.1% NP-40液中，洗涤7～8 min；转入70% 乙醇处理2 min，在室温下风干；加10 μL DAPI II于靶染色体区域，用盖玻片封片，置冰箱(-20 ℃)10～15 min，取出镜检或在-70 ℃低温冰箱中避光保存。

2　结果

鉴于人16号染色体是在IVF临床中常发生非整倍性的染色体之一，本研究选其着丝粒探针用于方法学的建立。我们用人16号染色体着丝粒探针与人外周血染色体核型进行荧光原位杂交作阳性对照，用人16号染色体着丝粒探针与小鼠卵母细胞染色体核型进行荧光原位杂交作阴性对照，结果在人外周血和人卵母细胞核型的16号染色体着丝粒区均见明亮清晰的荧光信号，而在阴性对照中未见荧光信号。除了应用人16号染色体着丝粒探针外，我们用人X染色体着丝粒探针与人卵母细胞核型进行荧光原位杂交也获得了同样的效果。应用本文报道的方法，我们在上百批次实验中所制备的人卵母细胞染色体形态与分散良好，荧光信号明亮、清晰，背景干净(图1)。

3　讨论

3.1人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术要点

人卵母细胞来之不易且数量有限，因此要求实验成功率高，不致浪费珍贵的材料；而且高质量的染色体核型制片是成功进行荧光原位杂交的保证，所以本技术的重点在于人卵母细胞染色体制片：①使用了3种固定液，它们除含甲醇和冰醋酸外，还含有不同比例的水。由于固定液I中含有一定比例的水，使从含有大量水的低渗液转入固定液I的卵母细胞，环境变化不像直接到常规固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)中那样激烈，而且还起到边低渗边固定的作用；固定液III中的水有使细胞软化的作用，这种渐进固定法使得卵母细胞染色体形态和分散良好，且不至丢失。②当卵母细胞由低渗液转入盛有固定液I的凹玻板底部时，应用吸管中随卵带来的少量低渗液覆盖卵母细胞，这样处理使固定液逐渐透过覆盖卵母细胞的低渗液去固定卵母细胞，达到更好的固定效果。此处的关键是要掌握好覆盖卵母细胞的低渗液量，过少则卵母细胞很快就飘动在固定液中，难以捕捉而丢失；过多则固定时间较长，染色体制片胞浆太厚，影响荧光原位杂交效果。③用固定液II挥发的气体在卵母细胞上方薰蒸，可使卵母细胞迅速变得扁平，能更好地固定在制片上。此处的关键是薰蒸卵母细胞的时间要掌握恰当。过快则染色体容易丢失；过慢则制片上的胞浆起皱，影响荧光原位杂交效果。④荧光素暴露在光线下会迅速褪色，为了避免荧光衰减，对所有涉及荧光素的溶液和制片的操作步骤都必须避光进行。⑤染色体制片和荧光探针变性时必须确保达到设定温度。

图1　荧光原位杂交(FISH)结果图

3.2人卵母细胞染色体荧光原位杂交技术应用前景

减数分裂是生物实现有性生殖的核心和根本。人类减数分裂，特别是在卵子发生过程中，最易发生错误[4]。据统计，人类临床妊娠至少有5%为非整倍体患儿，其中约90%系母方减数分裂错误所致，错误发生频率随着母方年龄增高而增加[5]；因此非整倍性发生机制及其与母方年龄的关系一直是学者们高度关注的课题。在IVF项目中，受精率与治疗结果密切相关。有研究报道，染色体异常是卵母细胞不受精的原因之一，并认为这是人类受精机理的知识中尚未涉及到的一种新的病理现象[6]，需要进一步研究证实。随着现代工业的发展，大量化学物质释放到自然界中，对人类居住环境造成极大的污染。有资料表明，近半个世纪以来，由于环境因素的影响，我国男性精子数量降幅已达40%以上；而且工业化程度越高的地区，精子质量下降速度越快[7]。环境因素对人卵母细胞有何负面的遗传学影响，迄今尚是一片空白。本文建立的技术可通过检测人卵母细胞染色体畸变来揭示母方减数分裂错误及其发生的原因、探索卵母细胞染色体异常在受精机制中的作用和评价环境因素对人卵母细胞的遗传学效应，对于人类生殖健康具有十分重要的理论与实践意义。

[1] Rudak E，Jacobs PA，Yanagimachi R. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa[J]. Nature，1978，274(5674)：911-913.

[2] Garcia-Cruz R，Casanovas A，Brieño-Enríquez M，et al.

Cytogenetic analyses of human oocytes provide new data on nondisjunction mechanisms and the origin of trisomy 16[J]. Hum Reprod，2010，25(1)：179-191.

[3] Fauser BC，Devroey P，Diedrich K，et al. Health outcomes of children born after IVF/ICSI：a review of current expert opinion and literature[J]. R eprod B iomed O nline，2014，28(2)：162-182.

[4] Warburton D. Human female meiosis：new insights into an error-prone process[J]. Am J Hum Genet，1997，61(1)：1-4.

[5] Hassold T，Abruzzo M，Adkins K，et al. Human aneuploidy：incidence，origin，and etiology[J]. Environ Mol Mutagen，1996，28(3)：167-175.

[6] Smith R，Walker L，Cobo AC，et al. Contribution of chromosomal abnormalities to in vitro fertilization failures[J]. Rev Med Chil，1998，126(5)：511-519.

[7] 张树成，王宏毅，王介东. 1981-1996年我国男性精液质量的变化分析[J]. 生 殖与避孕，1999，19(1)：27-33.

A refined technique for fluorescence in situ hybridization with human oocyte chromosomes

LI Penghao，QU Ting，HUANG Jihua，HAN Tingting，WEN Zina，CUI Shuyan，ZHONG Ying*
(Jinxin Research Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Chengdu Jinjiang Hospital for Maternal and Child Health Care, Chengdu 610066, Sichuan, China)

R394-3

A

1004-616X(2016)02-0131-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.010

2015-10-12；

2016-01-19

四川省科技计划项目(2012JY0066)

作者信息： 李鹏昊，E-mail：marklee20017@hotmail.com。*

，钟影，E-mail：yzhong08@126.com