HPLC测定不同干燥方法亳菊中5种成分的含量*

郑　娟，王国凯，刘劲松，张　伟

(安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽　合肥　230012)



分析测试

HPLC测定不同干燥方法亳菊中5种成分的含量*

郑娟，王国凯，刘劲松，张伟

(安徽中医药大学药学院，现代中药安徽省重点实验室，安徽合肥230012)

通过高效液相色谱法建立测定不同干燥方法亳菊中绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、木犀草苷和金合欢素的含量的方法。采用菲罗门C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-0.1% 磷酸水为流动相，梯度洗脱，流速：1.0 mL·min-1，检测波长325 nm，柱温30 ℃。绿原酸41.50～0.83×103μg·mL-1木犀草苷2.45～122.50 μg·mL-1、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸15.78～1.58×103μg·mL-1、木犀草素327.33～1.96×103μg·mL-1、金合欢素7.62～762 μg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系，回归方程分别为y=3.3257x-10.6227 (r=1.0000)、y=0.9865x+0.1356 (r=1.0000)、y=3.6681x-27.6275 (r=0.9999)、y=1.2538x-4.3563 (r=1.0000)和y=3.6216x-1.2515 (r=1.0000)。加样回收率分别为97.97%、97.49%、97.79%、98.27%、98.90%，RSD均小于5%。该方法快速，简便，重复性好，适合于同时测定亳菊中绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、木犀草苷和金合欢素的含量。

亳菊；绿原酸；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸；木犀草素；木犀草苷；金合欢素

菊花为菊科植物ChrysenthemummorifkliumRamat.的干燥头状花序，是药食同源的植物，始载于《神农本草经》，性平，味甘，微苦，归肺、肝经，具有疏风清热、平肝明目的功效，用于风热表证，温病初起，目赤肿痛、目暗昏花，头目眩晕[1]。2015年版中国药典按产地和加工方法，分为亳菊、滁菊、贡菊、杭菊和怀菊[2]。9-11月花盛开时分批采收，阴干或焙干，或熏、蒸后晒干[3-7]。亳菊因霜期较早，易受霜害变色，霉变，因此需要一种不影响有效成分含量的干燥方法。木犀草素、金合欢素等黄酮类成分是菊花中主要活性成分[8]，文献报道[9-13]的基础上，本文通过高效液相色谱法建立不同的干燥方法测定亳菊中绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、木犀草苷和金合欢素的含量的方法，结合15版药典一部，增加了木犀草苷和金合欢素的含量测定，以便更全面的、更快速的检测菊花的质量，为下一步研究提供依据。

1　仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪,色谱柱为菲罗门C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AS3120超声清洗仪,天津奥特赛恩斯；甲醇及乙腈(色谱纯)；水为市售娃哈哈纯净水；CP225D十万分之一电子天平,德国赛多利斯。绿原酸对照品(批号CF1026，纯度≧98%),武汉天植生物技术有限公司；3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(批号CF0973，纯度≧98%),武汉天植生物技术有限公司;木犀草素对照品(批号：111520-200504),中国药品生物制品检定研究院；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(批号CF0919，纯度≧98%),武汉天植生物技术有限公司、金合欢素对照品(纯度≧98.5%)，武汉天植生物技术有限公司。亳菊药材采自亳州，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为Dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel. ‘Boju’cv.nov. 的干燥头状花序。

2　方法与结果

2.1亳菊的不同加工方法

2.1.1阴干品的制备

亳菊于阴凉通风处至完全干燥。

2.1.2不同温度干燥品的制备

取200 g新鲜的亳菊分别放入恒温鼓风干燥箱内，分别设置干燥温度为40、50、60、70、80、90和100 ℃，干燥至重量小于15%鲜重，即为完全干燥，粉碎，待用。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件

菲罗门C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：乙腈为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，按表1梯度洗脱；检测波长：325 nm，柱温30 ℃，理论板数按3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰计算应不低于8000；流速：1.0 mL·min-1。

表1　流动相梯度洗脱条件

2.2.2供试品溶液的制备

取药材粗粉(过一号筛)1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，第一次精密加入70%甲醇50 mL，回流提取1.5 h，第二次加入甲醇40 mL，回流提取1.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，70%甲醇定容至25 mL，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品4.15 mg、木犀草苷对照品2.45 mg、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品7.89 mg，木犀草素对照品9.82 mg、金合欢素对照品3.81 mg分别置5 mL棕色容量瓶中，加入70%甲醇溶解后定容，摇匀，即得各对照品储备液。分别精密移取绿原酸对照品3 mL、木犀草苷对照品1 mL，3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品0.5 mL，木犀草素对照品3 mL、金合欢素对照品2 mL置10 mL的容量瓶中，加70%甲醇稀释定容，摇匀，即得混合对照品储备液。

2.2.4系统适应性

吸取制备的供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，HPLC图谱见图1。由图1可知各成分分离度良好，与其他成分达到完全分离。

图1混合对照品(A)及亳菊样品(B)的HPLC图

Fig.1Chromatograms of the mixed solution of reference substance (A) and the sample solution ofDendranthemamorifolium(B)

2.2.5标准曲线的绘制

精密移取混合对照品储备液10 mL，5 mL，2.5 mL，0.5 mL，0.25 mL，0.025 mL分别置10 mL的容量瓶定容，精密吸取上述各溶液20 μL进样。以峰面积(y)对绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、金合欢素浓度(x)进行线性回归，计算各组分的回归方程，结果见表2。其线性范围分别为绿原酸41.50～0.83×103μg·mL-1、木犀草苷2.45～122.50 μg·mL-1、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸15.78～1.58×103μg·mL-1、木犀草素327.33～1.96×103μg·mL-1、金合欢素7.62～762 μg·mL-1。

表2　5种成分标准曲线

2.2.6精密度试验

取同一供试品溶液重复进样5次，每次20 μL，测定峰面积，计算RSD值。绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，木犀草素、金合欢素精密度RSD值分别为1.23%、0.99%、1.91%、0.33%、0.42%。表明本法精密度良好。

2.2.7重复性试验

按供试品制备方法制备同一供试品5份，分别进样20 μL，测定峰面积，计算RSD值。绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，木犀草素、金合欢素重复性结果RSD值分别为0.59%、0.88%、1.57%、3.09%、2.60%。表明本法重复性良好。

2.2.8稳定性试验

取对照品溶液分别于 0、3、6、9、12和24 h测定峰面积，计算RSD值。绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，木犀草素、金合欢素稳定性试验结果RSD值分别为1.83%、0.42%、1.41%、0.79%、0.30%。表明本法稳定性良好。

2.2.9加样回收率试验

取已测知含量的药材，精密称定，然后按样品溶液制备方法制备，分别精密加入混合对照品溶液适量，分为高、中、低浓度加样回收，测定，计算出回收率。绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸，木犀草素、金合欢素回收率分别为97.97%、97.49%、97.79%、98.27%、98.90%。RSD值分别为1.92%、0.86%、1.31%、3.44%、1.44%。表明本法回收率良好。

表3　加样回收率试验(n=6)

3　结　果

不同干燥方法的亳菊中绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、金合欢素的含量各不同，结果见表4和图2。

表4　亳菊样品的含量测定结果

图2　亳菊样品的含量测定结果

4　讨　论

根据2015年版药典规定按干燥品计算绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量分别不低于0.20%、0.080%、0.70%，阴干组分别为1.83%、0.26%、9.06%，40 ℃烘干组分别为0.21%、0.10%、0.18%，50 ℃烘干组含量分别为0.13%、0.07%、0.12%，60 ℃烘干组含量分别为0.13%、0.06%、0.13%，70 ℃烘干组含量分别为0.11%、0.04%、0.06%，80 ℃烘干组含量分别为0.14%、0.06%、0.13%，90 ℃烘干组含量分别为0.18%、0.06%、0.05%，100 ℃烘干组含量分别为0.20%、0.04%、0.11%，故以阴干组最佳。木犀草素以阴干组含量最高，烘干后木犀草素会明显降低。金合欢素以50 ℃烘干时含量最高，90 ℃烘干时含量次之，超过阴干组含量。由表4及图2可知，以该方法测量的阴干组、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃烘干组中绿原酸、木犀草苷、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、金合欢素总含量以新鲜菊花阴干含量最高，经过烘干加工后的亳菊总含量均下降，因此以烘干方法加速菊花的干燥工艺有待进一步研究。探索出温度对各组分的影响过程，才能更好地在干燥菊花的同时尽量不降低菊花中有效部位含量。

本实验分别考察了药典中的超声方法和回流提取作对比，发现回流方法要比超声提取物程中发现，以新鲜菊花所做的阴干组阴干所用时间最长，其次是40 ℃烘干时间，并且40 ℃烘干后易返潮，霉变。100 ℃烘干后菊花色泽明显变焦化趋势，以新鲜菊花阴干和50 ℃烘干色泽最好。通过文献[14]测定绿原酸的紫外吸收峰为330 nm，以及文献[15-16]测定绿原酸时，选择的325 nm，综合考虑选择325 nm作为本实验的检测波长，实验结果显示在此波长下的各测定成分的含量变化和峰面积响应以及线性都较好。HPLC 同时测定提取物中绿原酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、木犀草苷、金合欢素的含量，实验结果的精密度、线性关系、重复性、回收率数据均符合测定要求，因此，该实验方法可快速准确地为菊花的质量控制和临床使用提供重要的参考数据。

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Determination of Five Components inDendranthemamorifoliumUsing Different Dry Methods by HPLC*

ZHENGJuan,WANGGuo-kai,LIUJin-song,ZHANGWei

(School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Anhui Key Laboratory for Modern Chinese Materia Medica, Anhui Hefei 230012, China)

A sensitive and specific high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed to determine chlorogenic acid, 3,5-Dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin inDendranthemamorifolium．The sample was extracted by reflux extraction. The chromatographic separation was carried out on a Phenomenex C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with acetonitrile and 0.1% phosphoric acid as mobile phases at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The UV detection wavelength was set at 325 nm，and the column temperature was set at 30 ℃. The linear correlation equations for chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin were y=3.3257x-10.6227 (r=1.0000), y=0.9865x+0.1356 (r=1.0000), y=3.6681x-27.6275 (r=0.9999), y=1.2538x-4.3563 (r=1.0000)和y=3.6216x-1.2515 (r=1.0000), respectively. A good linearity was obtained over the range of 41.50～0.83×103μg·mL-1, 2.45～122.50 μg·mL-1, 15.78～1.58×103μg·mL-1, 327.33～1.96×103μg·mL-1, 7.62～762 μg·mL-1, respectively. The recoveries of were 97.97%, 97.49%, 97.79%, 98.27%, and 98.90%, respectively. RSD both were less than 5%. The developed HPLC method was quick, simple and reproducible for the simultaneous determination of Chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoyl quinic acid, luteolin, luteolin-7-O-β-D-glucoside and acacetin inDendranthemamorifolium.

dendranthemamorifolium(Ramat.) Tzvel.‘Boju’cv. nov.; Chlorogenic acid; 3,5-dicaffeoyl quinic acid; luteolin; luteolin-7-O-β-D-glucoside; acacetin

安徽省科技攻关项目(1031043016)；国家自然青年基金(81303229)。

郑娟(1989-)，女，药物化学专业研究生。

刘劲松，副教授，主要研究方向：药物化学。

R284.2

B

1001-9677(2016)012-0108-03