应用H3K4B经皮肤进行siRNA传递的实验研究

锁琳琅 刘文辉 黄晓璐 李青峰

·论著·

应用H3K4B经皮肤进行siRNA传递的实验研究

锁琳琅 刘文辉 黄晓璐 李青峰

目的 探讨一种高效率、低毒性的经皮肤siRNA传递方式。方法 在含血清条件下，利用不同浓度梯度的H3K4B或10 KDa聚乙烯亚胺（PEI，阳性对照）将含有荧光标记的siRNA转染到原代成纤维细胞内，并在转染24 h后以流式细胞仪检测各浓度下H3K4B和PEI转染siRNA的效率，确定两者的最适转染浓度。采用CCK-8法检测并比较H3K4B和10 KDa PEI在最适转染浓度下的细胞毒性。使用皮内注射将siRNA-H3K4B复合物转染进大鼠皮肤内，转染6 h、24 h、48 h和72 h后采集皮肤样本进行冷冻切片，荧光显微镜下观察siRNA是否成功传递到皮肤内。结果 在含血清条件下，H3K4B和10 KDa PEI的最佳转染效率比为1∶4。CCK-8实验证实，H3K4B的毒性低于10 KDa PEI。皮内注射能将siRNA-H3K4B复合物转染进全层皮肤内，但主要将复合物转染至真皮内，少量siRNA传递至表皮。结论H3K4B能高效地将siRNA传递至皮肤内，且毒性较低；皮内注射能协助传递过程，siRNA主要被传递至真皮内。

小干扰RNA 皮内注射 脂质体 经皮给药

利用小干扰RNA（siRNA）对各种疾病进行基因治疗，已成为新的研究方向，特别是在遗传性疾病的治疗方面［1-2］。皮肤是局部应用siRNA进行治疗最方便的器官［3］，经皮肤进行siRNA传递可以将siRNA传递到皮肤或体内其他靶器官，是一种非常有前景的治疗皮肤［4-6］乃至全身疾病［7-8］的方法。使用皮肤传递siRNA的优点在于：①全身毒性小；②生物利用率高；③治疗区域容易进行监测、取材或手术切除［2-3］。对于皮肤相关疾病，经皮siRNA传递更具备直接进入靶细胞，且对治疗以外区域影响较小的优点。关于siRNA治疗皮肤相关性疾病的研究已有了丰富的成果［9］。但目前缺乏满意的皮肤传递治疗方式，siRNA在治疗皮肤病方面的临床应用依然受到阻碍［10］。

裸siRNA在传递过程中易降解，从而导致利用率低［3，11-12］，因此病毒及非病毒载体被用于协助siRNA进入宿主细胞。然而，细胞毒性、免疫原性和致癌性等限制了病毒载体在siRNA传递过程中的应用［13-14］。脂质体和细胞穿透肽等非病毒载体，易修饰，相对安全，成为了siRNA传递的主要工具［2］。细胞穿透肽高效、低毒，是极具前景的一类转染试剂［15-16］。

具有分支结构且富含组氨酸和赖氨酸的多肽（Histidine-lysine-rich peptide，HKP）是一种安全高效的细胞穿透肽，广泛用于将核酸传递至不同类型的组织及细胞中［17-21］。H3K4B作为HKP家族成员，已被证实在体内和体外能将siRNA传递到靶细胞内［18，20］，但其在皮肤中的应用尚未得到探究。因此，本研究旨在探讨采用H3K4B在皮肤中传递siRNA的效率，并尝试采用皮内注射协助siRNA-H3K4B复合物的皮内传递［22］，以建立经皮siRNA传递方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

雄性SD大鼠（我院动物中心）12只，7～8周龄。

原代成纤维细胞取自3日龄的SD大鼠，细胞培养采用含10%胎牛血清 （Gibco公司，美国）的DMEM高糖培养基（Hyclone公司，美国）。

1.2 转染剂、转染设备和siRNA

本实验使用两种载体：H3K4B（苏州圣诺生物医疗技术有限公司），聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI，10 KDa；上海源叶生物科技有限公司）。实验同时使用荧光素标记的FAM-siRNA（上海吉玛制药技术有限公司），1 mL 29G舒锐胰岛素注射器 （BD公司，美国）。

1.3 验证siRNA载体体外转染的最佳转染率

研究表明，siRNA与H3K4B的最佳转染率大约为1∶4（w/w），该比例在多种细胞系中都已被证明效果良好［17-19］。为了验证该比率的转染效率，本研究采用固定浓度的siRNA（1.25 μg/mL）和几种浓度的H3K4B（1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL 和20 μg/mL），转染成纤维细胞。同时采用上述系列浓度梯度的10 KDa PEI（Polyethylenimine，PEI）进行转染试验。10 KDa PEI转染效率高，在体内及体外的细胞毒性低［23］，用作阳性对照。

siRNA转染：当原代成纤维细胞融合度达到60%～80%时，采用siRNA-载体复合物进行转染，荧光素标记的siRNA不针对任何特定的序列，不会对细胞的生长过程造成干扰，被广泛用于阴性对照。在转染过程中H3K4B和10 KDa PEI分别使用不同的缓冲体系进行转染。H3K4B采用的是含10%胎牛血清的DMEM，而PEI采用5%葡萄糖溶液［24］。然后，加入siRNA于六孔板内，每个孔再逐滴加入200 μL的转染试剂。用于转染的H3K4B浓度为1.25 μg/mL，而PEI为5 μg/mL。载体和siRNA须在室温下反应30 min。反应30 min后，将转染复合物逐滴加入培养基中。对照组仅以相同浓度的转染试剂处理细胞。为了尽量减小转染试剂对细胞的损害，在转染6 h后更换全部培养液。转染完成后进行流式细胞仪和荧光显微镜检测。

流式细胞仪检测转染效率：为了确定转染效率和最佳转染比例，转染完成后的细胞经PBS清洗3次，用0.25%胰蛋白酶消化并重悬，吹打均匀，采用流式细胞仪检测转染细胞中荧光标记siRNA的转染效果。以阳性细胞占细胞总数的百分比计算转染效率，我们把取得最高转染效率的最低转染试剂浓度定义为该试剂的最佳转染浓度。

荧光显微镜检测：转染24 h后，采用荧光显微镜观察细胞并拍照，以确定siRNA是否转染成功。吸取培养基，采用含有4%甲醛溶液的PBS于37℃转染固定细胞15 min。然后采用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）对固定的细胞进行染色，荧光显微镜下观察。

1.4 体外细胞毒性分析

在确定各转染试剂的最佳转染浓度后，使用CCK-8进行体外细胞毒性分析。取原代成纤维细胞悬液（2 000个/孔）接种到96孔板中培养，常规培养24 h。分别加入最佳转染浓度的H3K4B和10 KDa PEI至96孔板内。加了转染剂的培养液继续孵育6 h后更换培养基，并将未进行转染的细胞设为对照组。每组设5个平行复孔，继续培养24 h、48 h和72 h。检测前每孔加入10 μL CCK-8显色剂，37℃培养箱孵育2 h，使用酶联免疫检测仪于450 nm处测定细胞培养24 h、48 h和72 h的吸光度值。

1.5 体内转染

我们使用皮内注射来辅助H3K4B的体内转染。对已麻醉的SD大鼠背部备皮，按照上述方法制备siRNA-载体复合物，为了提高转染效率，我们把siRNA及载体的量提高10倍，但仍然保持最佳转染效率比。在注射部位标记后，立刻将50 μL siRNA-载体复合物以皮内注射方式注入大鼠背部皮肤，以相同浓度的转染试剂注入同一只大鼠背部皮肤作为对照，分别在6 h、24 h、48 h和72 h取材，每个时间点取材3只。皮内注射后的大鼠分别在6 h、24 h、48 h及72 h后处死，注射部位的皮肤标本进行冰冻切片后行DAPI染色并在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 体外转染

流式细胞仪检测结果显示，对于H3K4B和10 KDa PEI，最佳转染效率比均为1∶4（图1A），即H3K4B和10 KDa PEI的最佳转染浓度均为5 μg/mL。在最佳转染浓度下，H3K4B和10 KDa PEI有相似的转染率，阳性率大约在95%左右，且H3K4B组的平均荧光强度较PEI组高（图1B-C）。在H3K4B最佳转染浓度下siRNA成功转染成纤维细胞（图2）。

图1 H3K4B和10 kDa PEI的最佳转染效率比Fig.1 Optimal transfection ratios of H3K4B and 10 KDa PEI

图2 siRNA被H3K4B转染进成纤维细胞Fig.2 siRNA was delivered into fibroblasts by H3K4B

2.2 体外细胞毒性分析

细胞毒性测试结果显示，H3K4B的细胞培养存活率较10 KDa PEI的细胞要高。因此，H3K4B毒性较10 KDa PEI小（图3）。

图3 H3K4B和10 KDa PEI对细胞活性的影响Fig.3 Effect of H3K4B and 10 KDa PEI on cell viability

2.3 体内转染

采用皮内注射法进行体内转染，siRNA-H3K4B复合物被成功的传递至真皮层，少量siRNA传递至表皮。siRNA的荧光表达量随时间延长逐渐减少，在皮内注射后72 h内均能够检测到siRNA（图4）。

图4 siRNA皮内注射法体内转染的免疫荧光观察Fig.4 Immunofluorescence observation of siRNA in vivo transfection by intradermal injection

3 讨论

缺乏高效而低细胞毒性的siRNA经皮肤递送方法，是经皮siRNA治疗的主要障碍。本研究尝试使用H3K4B进行siRNA经皮肤递送。体外实验测定了siRNA与H3K4B的最佳转染比例，体外细胞毒性分析显示，H3K4B的细胞毒性较低。此外，我们还建立了经皮肤递送siRNA的实用方法。皮内注射能协助siRNA递送至皮肤全层。皮内注射主要将siRNA递送入真皮，更适用于真皮内的传递。因此，本研究建立了一种高效低毒的体外和体内转染siRNA的方法，可用于实验研究和临床转化。

最佳转染比例下，使用H3K4B转染siRNA到成纤维细胞的效率高达95%。阳性对照组10 KDa PEI同样取得了很高的转染效率，但其细胞毒性却高于H3K4B。早期研究表明，HKP家庭成员H3K4B比其他阳离子多聚物（包括脂质体2000）的细胞毒性更小［17］。此外，我们发现，转染后siRNA在皮肤至少存留了72 h，表明了H3K4B对siRNA能起到很好的保护作用。需要指出的是，siRNA的荧光在自然状态下会逐渐淬灭，所以siRNA在皮肤存留的时间可能比siRNA的荧光能被检测到的时间还要长。事实上，间隔4 d的siRNA全身给药频率被证明是有效的［18］，而我们已提出了类似的发现。因此，未来的相关研究需要对siRNA递送剂量和频率作优化。

角质层是各种分子经皮肤递送的主要障碍［3］。因此，我们使用皮内注射来辅助H3K4B介导的siRNA递送。皮内注射是较有效的siRNA递送方法［3］。本研究中，我们发现单次皮内注射主要将siRNA递送至真皮层，同时有少量siRNA传递至表皮层。Gonzalez等［25］发现，可使用为期14 d的多次真皮内注射实现有效的表皮siRNA递送。这表明剂量和给药频率的优化将可能成功实现表皮和真皮的siRNA递送。因而本研究中，我们使用真皮内注射，促进了H3K4B介导的siRNA皮肤递送，并成功将siRNA递送到了靶区域的大多数细胞中。

血清会干扰PEI等转染试剂的转染效率［26-27］。在血清存在的条件下，探究转染试剂的稳定性和效率是有必要的［17，28］。所以我们测试了在存在血清的条件下，转染试剂的效率和细胞毒性。本研究中，血清可能降低了10 KDa PEI的转染效率，导致达到目标转染效率所需的PEI用量增加，进而增加细胞毒性。然而，尚没有报道显示，血清会对HKP家族成员的稳定性和转染效率造成影响［19-21，29］。 这提示，H3K4B在体内应用时，会有比较高的效率和安全性。

本研究的主要局限在于缺乏明确的H3K4B细胞毒性试验。然而，HKP家族成员已被证明比各种阳离子多聚物的细胞毒性都低得多［17，29］，而本实验也初步证明了H3K4B的低细胞毒性。另外，转染试剂的修饰是一个研究热点，已取得长足的进步［3］。修饰后的转染试剂能特异性靶向结合特定的细胞或组织，且使用的剂量更少、细胞毒性更低。例如，H3K4B的聚乙二醇化使其可经全身给药后靶向作用于皮下肿瘤［20，30］。因此，今后的研究应侧重于H3K4B的修饰和靶向皮肤疾病制剂的开发。靶标特异性的H3K4B可以在更低剂量下得到更高的效率，这将极大降低H3K4B的细胞毒性。

本研究探讨了H3K4B对成纤维细胞的影响。虽然成纤维细胞是皮肤的主要细胞类型，但H3K4B对其他类型的细胞，包括免疫细胞、黑色素细胞和表皮干细胞等的影响尚未明确。因此，我们需要进一步研究H3K4B对这些细胞的影响。

4 结论

H3K4B成功将siRNA递送到皮肤，该方法有着较高的效率和较低的细胞毒性，使它可能成为一种治疗皮肤病的实用载体。使用皮内注射可通过微创方式将siRNA转染至真皮内。本研究建立的siRNA经皮肤传递的方法对将来的实验研究和临床转化将有所助益。

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Experimental Research of Transdermal siRNA Delivery with H3K4B

SUO Linlang，LIU Wenhui，HUANG Xiaolu，LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LI Qingfeng
（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

Objective To explore a highly efficient method of cutaneous siRNA delivery with low toxicity.Methods In serum containing conditions，using H3K4B or 10 KDa polyethylenimine （PEI，positive control）with different concentration，fluorescently-labeled siRNA was transfected into primary fibroblasts.Flow cytometry was carried out to verify the optimal transfection ratio of siRNA to H3K4B/PEI at 24 h after the transfection.The cytotoxicity of H3K4B and 10 KDa PEI were compared using the CCK-8 assay.An intradermal injection was used to deliver siRNA into the skin along with H3K4B.At 6，24，48 and 72 h after in vivo transfection，skin samples were harvested for frozen sectioning.The sections were observed under fluorescence microscope to check whether siRNA had been successfully delivered into the skin.Results For both H3K4B and 10 KDa PEI，optimal transfection efficiency was achieved at the ratio of 1∶4.At the optimal transfection concentration，H3K4B was less cytotoxic than 10 KDa PEI showed by CCK-8 assay.The intradermal injection successfully delivered siRNA along with H3K4B into the dermis，a small amount of siRNA was also delivered into the epidermis.Conclusion H3K4B could deliver siRNA into the skin with high efficiency and low cytotoxicity.The intradermal injection deliver siRNA into the dermis mainly.

Small interfering RNA；Intradermal injection；Liposome；Transdermal delivery

R622

A

1673－0364（2016）04－0217－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.003

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

（2016年5月20日；

2016年7月23日）