拟南芥多聚ADP核糖聚合酶活性调控植物的抗旱性

刘财丰，吴　殷，刘伟伟，葛晓春

(1. 复旦大学 生命科学学院 上海 200438； 2. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海200438)



拟南芥多聚ADP核糖聚合酶活性调控植物的抗旱性

刘财丰1,2，吴殷1,2，刘伟伟1,2，葛晓春1,2

(1. 复旦大学 生命科学学院 上海 200438； 2. 复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海200438)

为了观察植物多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]的酶活对植物生长的作用，利用PARP抑制剂来抑制拟南芥PARP的体内活性，并观察表型.体外生化实验结果表明，3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)可以抑制拟南芥PARP1和PARP2的多聚ADP核糖化修饰活性；利用3-AB来处理拟南芥，发现抑制剂处理过的植物表现出更强的耐旱能力.为了排除3-AB的非特异性作用，使用PARP的另外一个抑制剂苯甲酰胺(Benzamide, BA)对拟南芥进行处理，结果显示，BA处理后拟南芥也表现出相似的抗旱表型.另外，在正常生长条件下，3-AB或BA处理过的拟南芥生长量较大，植株鲜重明显增加.以上结果说明，抑制拟南芥PARP活性可以促进拟南芥抗旱能力的改善，其抑制剂具有潜在的应用价值.

拟南芥； 多聚ADP核糖聚合酶； 3-AB； BA； 抗旱性

蛋白质翻译后修饰是蛋白质功能的重要调控手段，常见的方式有糖基化修饰、泛素化修饰、磷酸化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰等[1].多聚ADP核糖化[poly(ADP-ribosyl) ation] 修饰是一种稀有的蛋白质翻译后修饰方式[2].该修饰由多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase, PARP]催化，它以NAD+为底物，将其裂解为ADP核糖(ADP-ribose， ADPR)和尼克酰胺两部分，并将其中的ADP核糖基团转移至靶蛋白.通过反复催化，PARP在蛋白质上加上几十个到几百个不等的ADP核糖单元，形成线性或分支的多聚ADP核糖链，从而改变了受体蛋白的生理或生化活性[3].PARP对断裂DNA有天然的亲和性，它可以检测到细胞内的DNA断裂，从而结合到断裂位点，发生自我修饰，并通过其自身连上的多聚ADP核糖链募集其他与DNA修复有关的蛋白，参与到DNA修复过程[4].

从动物细胞中发现，多聚ADP核糖化修饰是一种可逆的修饰，细胞内多聚ADP核糖[poly(ADP-ribose), PAR]的水平受到PARP和多聚ADP核糖糖基水解酶[poly(ADP-ribose) glycohydrolase, PARG]的严格调控[5].PARG是一种与PARP活性相拮抗的酶，可以降解多聚ADP核糖成为单ADP核糖(ADPR)[6]，从而去除蛋白质上的多聚ADP核糖基团.PARP与PARG活性的平衡维持着细胞内多聚ADP核糖化的正常水平，保持了动物体内正常的生理功能[7].迄今为止，在人类中通过序列同源性共发现了17个PARP家族成员[8]，它们均具有PARP催化结构域，存在于细胞核或细胞质中.在动物中，多聚ADP核糖化修饰在多个细胞过程中起关键作用，包括基因转录调控、有丝分裂、DNA损伤反应、细胞程序性死亡、染色质结构重组、胁迫响应等[9-11]；在人类个体水平上，多聚ADP核糖化修饰与心脏病、白血病、阿尔兹海默病以及癌症组织对化疗的敏感性有关[12].因此，动物中PARP的功能和作用机制得到了不少研究者的关注和深入研究.

高等植物具有两个以上PARP基因[13-14]，和动物中PARP基因功能的广泛研究相比，目前对植物PARP基因功能的研究非常少.拟南芥基因组具有3个PARP基因，它们分别是PARP1(At4g02390)，PARP2(At2g31320)和PARP3(At5g22470)[15-16].拟南芥PARP1和PARP2分别是哺乳动物PARP1及PARP2是直系同源物，暗示其功能在动植物间可能具有保守性.PARP3则为植物中所特有，在发育的种子中高表达，表明其功能可能与种子发育相关[16].PARP1和PARP2在植物中主要与非生物[17-19]以及生物[20]胁迫信号途径相关.PARPs影响植物体内ABA的水平，参与ABA信号途径的调控[21]，下调PARPs的表达水平能够增强植物对高温等非生物胁迫的耐受能力.PARPs参与抗逆的具体机制到目前为止仍不十分清楚，还需要进一步的研究.

动物中常用的PARP抑制剂3-AB，BA，尼克酰胺(Nicotinamide, Nic)和3-甲氧基苯甲酰胺(3-Methoxybenzamide, 3-MB)都属于竞争性抑制剂[22]，可以结合在PARP酶的活性中心.它们都有一个苯甲酰胺基团，作为NAD+的结构类似物竞争结合PARP的活性位点，从而阻止NAD+与PARP的结合.目前尽管PARP抑制剂已被用于植物的研究，但它们是否可以对拟南芥中PARP生化活性产生抑制作用还没有直接证据.本研究首先利用生化方法观察了PARP抑制剂3-AB对拟南芥中PARP1和PARP2活性的作用，然后采用PARP抑制剂处理拟南芥，观察其表型，为深入了解PARP在植物中的功能以及发掘PARP抑制剂可能的应用价值提供基础.

1　材料与方法

1.1材料

拟南芥ArabidopsisthalianaColumbia-0生态型(Col-0). 3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide, 3-AB)购自Alfa Aesar试剂公司，苯甲酰胺(Benzamide)购自国药集团化学试剂有限公司.大肠杆菌E.coliDH5α，BL21(DE3)，Rosetta(DE3)，Origami(DE3)，表达载体pET-32(a)均为本实验室保存.DNA聚合酶，各种限制性内切酶，以及T4 DNA连接酶等均购自TaKaRa公司，PCR引物合成和DNA测序由上海博尚生物科技有限公司完成.

1.2方法

1.2.1植物培养

土壤中培养拟南芥： 基质(V蛭石∶V黑土∶V珍珠岩=9∶3∶1)浸透营养液后，将种子播于其上，用保鲜膜覆盖，置于4℃下春化2d后转入短日照(9h光照/15h黑暗)温室，(22±2)℃条件下进行培养.

培养基上培养拟南芥： 种子用1mL 70% 乙醇灭菌10min，然后换1mL 100% 乙醇+0.01% Triton X-100，振荡几次后置于灭菌的干净滤纸上，待乙醇挥发后，点播在1/2 MS平板上.将平板置于4℃冰箱中春化处理2d，然后转移到(9h光照/16h黑暗)光照培养箱或短日照(9h光照/15h黑暗)温室，(22±2)℃的条件下进行培养.

1.2.2拟南芥抗旱实验以及叶片相对含水量测定

移栽拟南芥时每个小盆中先称取相同质量的土，移栽时尽量选取大小以及生长状态一致的野生型小苗.在短日照培养7d后开始用2mmol/L 3-AB和BA处理，每隔5d处理1次，共处理4次，对照组用等量水处理.移栽30d后将拟南芥用水浇透，称重，尽量保证每个小盆中含水量一致，然后停止浇水，使其自然干旱，直至萎蔫，在萎蔫出现后适当时间复水，拍照.干旱前、干旱进行时及复水后各收集1次植物的叶片，剪取后马上称重得到植物叶片鲜重(Fresh Weight, FW)；然后将植物叶片浸入水中4h后取出，用草纸吸干叶子表面的水分，称重，得到植物叶片的湿重(Turgid Weight, TW)；将称过的叶片放入80℃烘箱中完全烘干，直至叶片重量不再变化时为止，称取干重(Dry Weight, DW).叶片的相对含水量(Relative Water Content, RWC)根据公式RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100%计算.

1.2.3PARP表达与纯化

pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2的表达载体构建： 根据PARP1和PARP2的全长cDNA序列，分别设计上下游引物PARP1-SacI-FP(5′-GGAGCTCATGGCAAGCCCACATA-3′)和PARP1-NotI-RP(5′-GGCGGCCGCTCATCTCTTGTGCTTA-3′)，PARP2-BamHI-FP(5′-GGGATCCATGGCG AACAAGCTCAAAGTC-3′和PARP2-XhoI-RP(5′-GGAGCTCGTGCTTGTAGTTGAATTTGACTTG-G-3′), 用高保真的DNA聚合酶Prime STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)进行扩增，回收大小正确的条带，用T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)连接到pCR-Blunt Ⅱ(Invitrogen公司)中间载体上，转化E.coliDH5α, 挑选单菌落，摇菌并抽提质粒，测序.得到序列正确的克隆后，抽提质粒DNA，分别进行双酶切，与带有同样粘性末端的pET-32(a)载体连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，挑单菌落摇菌并抽提质粒，酶切鉴定确认克隆pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2构建完成.

pET-32(a)-PARP1和pET-32(a)-PARP2表达条件的确定： 为了探索融合蛋白合适的表达条件，尝试了3种宿主菌：E.coliBL21(DE3)、E.coliRossetta(DE3)和E.coliOrigami(DE3)，并选择3个表达条件，37℃诱导4h、25℃诱导10h和16℃诱导20h分别进行诱导，同时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG.将诱导表达后所得菌体超声波破碎后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳.结果显示，PARP1在E.coliOrigami(DE3)，PARP2在E.coliRossetta(DE3)中16℃诱导20h能获得较多的可溶蛋白.

PARP1和PARP2的大量表达、纯化以及透析： 进一步将含有pET-32(a)-PARP1的E.coliOrigami(DE3)和含有pET-32(a)-PARP2的E.coliRossetta(DE3)扩大培养至500mL, 摇菌至OD600为0.6～0.8 时，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，然后在16℃继续培养20h.离心收集菌体，重悬后超声波破碎，离心得到上清，过Ni2+-chelating Sepharose fast flow柱纯化，得到的蛋白在10mmol/L NaCl透析液中透析16～18h，期间换液3次以除去咪唑.同时，将转入空载体pET-32(a)的E.coliRossetta(DE3)在同样条件下表达，纯化，获得TRX标签蛋白用于测酶活的对照.

1.2.4体外抑制实验

向PAR反应缓冲液(50mmol/L Tris·HCl，4mmol/L MgCl2，250μmol/L DTT，2mmol/L EDTA，pH 8.0)中加入NAD+至0.1mmol/L，退火的双链DNA(5′-GGAATTCCGGAATTCC-3′)至500nmol/L，不加入(对照)或者加入1mmol/L 3-AB，最后加入0.2μg透析后的蛋白，总体积为200μL.上述样品于25℃分别反应0，1，5，15，30min后加入400μL～20℃预冷的丙酮终止反应，-20℃放置1h以沉淀蛋白.12000r/min离心10min，倒去上清，室温挥发尽丙酮后加入10μL 1×上样缓冲液溶解蛋白，取5μL进行SDS-PAGE电泳分析.TRX对照蛋白电泳时使用的胶浓度为15%，TRX-PARP1和TRX-PARP2使用的胶浓度为7.5%.

2　结果与分析

2.13-AB可以抑制拟南芥PARP的催化活性

拟南芥PARP1和PARP2具有和哺乳动物PARPs中类似的催化结构域和DNA结合域.研究人类PARP1的生化功能时发现，PARP的DNA结合域结合断裂的DNA后，发生构象变化，从而激活其催化结构域裂解NAD+，并将生成的ADP核糖转移到自我修饰结构域上，对自身进行多聚ADP核糖化修饰，从而导致自身分子量的增加[23-24].

在TRX-PARP1和TRX-PARP2活性检测液中加入NAD+底物，反应不同时间后加入丙酮终止反应，然后经过SDS-PAGE电泳分析TRX-PARP1和TRX-PARP2的泳动情况.同时，为了检测3-AB是否能抑制拟南芥PARP的活性，我们在平行实验中分别加入终浓度为1mmol/L的3-AB, 结果表明，TRX-PARP1和TRX-PARP2蛋白质在加入NAD+后，主带逐渐变淡，呈现出向上的弥散，时间越长，主带越弱，而向上扩散越严重，出现凝胶阻滞现象，表明大肠杆菌中表达的PARP1和PARP2均具有自我修饰活性(图1(a)，(b)).同时，我们发现PARP1的活性要强于PARP2.加入抑制剂3-AB后，PARP1向上弥散的趋势被大大抑制，而在PARP2中，这种向上弥散的趋势几乎被完全抑制.以同样的条件进行反应，作为标签蛋白的TRX蛋白的分子量和条带都没有明显变化(图1(c)).这些结果表明，大肠杆菌中表达的PARP1和PARP2具有自我催化多聚ADP核糖修饰反应的活性，3-AB可以抑制它们的催化活性.

2.2PARP抑制剂3-AB促进拟南芥抗旱

PARP抑制剂3-AB在动物中使用的IC50为1mmol/L[22].我们采用接近动物IC50的浓度范围来处理拟南芥，利用3-AB溶液浇灌拟南芥根部的方法来抑制PARP的活性.

拟南芥在短日照培养7d后，用1mmol/L和2mmol/L 3-AB按材料与方法中所述步骤进行少量多次浇灌拟南芥根部，30d后停止浇灌进行干旱.结果显示，干旱20d时对照组已基本枯死，而3-AB处理过的植物仍然存活，在这个时间点恢复浇水，两天后拍照(图2)，可以看到，3-AB处理后拟南芥在干旱胁迫下的生长状态明显好于对照，复水后基本能恢复生长，且2mmol/L 3-AB处理较1mmol/L处理效果更为显著.

2.3其他抑制剂也可促进拟南芥的抗旱性

为了排除3-AB的非特异性作用，本研究还使用了PARP的另外一个抑制剂BA来处理拟南芥.BA对PARP的作用机制和3-AB相似[22].尽管3-AB在临床和科研上应用广泛，但BA成本低廉，使用量较大的话更具备价格优势.BA对PARP的抑制力比3-AB稍弱，因此我们使用了2mmol/L的BA来进行处理.拟南芥在短日照培养7d后用 2mmol/L的BA水溶液浇灌其根部，同时，用等量2mmol/L 3-AB浇灌作为阳性对照，等量的水浇灌作为阴性对照，每隔5d处理1次，共处理4次.

停止浇水前的对照组、3-AB及BA处理组的植物的生长状态基本一致(图3)，但干旱20d后，对照组几乎干死，而3-AB及BA处理组则仍保持暗绿色，2mmol/L 3-AB处理拟南芥的植物状态稍好于2mmol/L BA处理的拟南芥.恢复浇水3d后观察表型，对照组不能恢复生长，而3-AB和BA处理组则可恢复生长(图3)，两者状态相差不多.以上结果表明，利用PARP抑制剂BA处理植物，也能达到与3-AB相类似的增强拟南芥抗旱性的效果，干旱20d后复水，植物均能恢复生长.

2.4叶片相对含水量测定

叶片相对含水量是植物抗旱性能的一种重要指标[25]，我们从对照和处理植物上剪取停止浇水前、恢复浇水前和恢复浇水后3d的叶片，测量3-AB、BA处理组与对照组的叶片的相对含水量.结果表明，在停止浇水前，PARP抑制剂处理的植物和对照组的叶片相对含水量几乎一致，但在干旱20d后，对照组的叶片相对含水量仅有20%多，表明大部分叶片已处于严重缺水的状态，而处理组中叶片相对含水量则保持在80%以上，此外3-AB处理的效果比同浓度的BA效果稍好(图4).恢复浇水后3d，对照组的叶片相对含水量不能有效地恢复，和复水前比没有显著差异，表明大部分植株已经死亡；而处理组的叶片相对含水量则和复水前比有显著的上升(P<0.01)，并且基本恢复到了干旱前的水平，和干旱前比没有显著差异.这些结果再次表明了3-AB或BA处理能够降低拟南芥在干旱处理时的脱水现象，大大增强拟南芥的干旱恢复能力.

2.5PARP抑制剂处理促进拟南芥鲜重增加

以上的结果表明PARP抑制剂处理可以显著提高拟南芥的抗旱能力，我们还进一步研究了PARP抑制剂处理是否会影响拟南芥在正常条件下的生长状况.拟南芥(Col-0)种子用乙醇消毒后均匀点播于含1/2 MS培养基的平皿中，在1/2 MS培养基上加入终浓度为1mmol/L 的3-AB或者2mmol/L BA，对照培养基中加入等量的灭菌水.生长20d后观察拟南芥小苗的表型，发现3-AB或BA处理后，拟南芥的生长状态更好(图5(a)).我们进一步将整株小苗轻轻拔出后将培养基清洗干净，然后分别称量拟南芥的鲜重，测量结果发现，3-AB或BA处理后，拟南芥鲜重显著增加(图5(b)).这些结果表明，利用PARP抑制剂处理过的植物在抗旱力增强的同时，正常生长并没有受到妨碍，相反，长势更强.

3　讨　论

PARP广泛存在于真核生物中，在动物中PARP1与PARP2受断链DNA的激活，参与DNA修复，维持基因组的稳定性，功能上具有一定冗余性[4].在不同的DNA损伤程度下，PARPs的激活表现出不同的作用： 当DNA只有轻微损伤时，适量PARP被激活，自身发生多聚ADP核糖化，蛋白质上合成的多聚ADP核糖链可招募DNA修复因子对DNA进行修复，有利于细胞保持正常的生命活动；如果胁迫过于严重导致DNA大量断裂时，PARPs被过度激活，引起细胞内大量的NAD+被消耗，NAD+的合成需要ATP，为了重新合成NAD+，细胞内ATP水平会发生严重下降，从而激活细胞内的坏死(necrosis)相关途径，使得细胞放弃修复而走向死亡途径[12].另外，PARPs的底物NAD+也是许多生物反应的辅酶，参与细胞内的氧化还原反应，帮助维持细胞内氧化还原状态[26].因此，为了避免NAD+被过度消耗，体内PARPs的活性需要维持在适当水平.

动物中PARPs的活性与多种疾病相关，使得它们成为疾病治疗的靶基因，其抑制剂的应用越来越受到重视.目前最常用的PARP抑制剂是PARP底物NAD+的类似物，例如尼克酰胺、苯甲酰胺、3-AB等[22,27]，许多体内研究的开展也依赖于抑制剂的使用.小鼠PARP1与PARP2单突变后对射线或者烷化剂过度敏感，但PARP1与PARP2双突变之后则表现出胚胎致死表型[4]，因此用双突变体来研究PARPs在生长发育过程中的作用几乎不可能，而使用抑制剂来抑制体内PARPs活性，则可以避免实验动物在胚胎期就死亡的问题，从而为研究PARPs在某一环节中的生理功能提供可能性[10,28].

拟南芥PARP1和PARP2与动物中的PARP具有同源性，但对其功能的研究较少.Block等[17]首先用PARP抑制剂3-MB等处理油菜的愈伤组织，发现PARP抑制剂能保护其不受氧化胁迫损伤；利用RNA干扰技术分别将拟南芥中的PARP1及PARP2基因的表达水平下调，拟南芥可表现出对干旱以及高光照等多种非生物胁迫的耐受性[21].我们在研究拟南芥PARP功能时，发现通过抑制剂3-AB或BA处理就可以使拟南芥抗旱性增强，叶片相对含水量更高.体外生化实验表明3-AB确实抑制了拟南芥PARP1和PARP2的生化活性，因此可以推断，3-AB通过抑制PARPs活性降低了NAD+的消耗，从而维持了细胞的能量平衡，减少胁迫导致的细胞死亡.使用抑制剂来研究基因功能比使用RNA敲除等转基因技术更为简单方便，蛋白质活性可控且可以同时抑制多个同源蛋白质的活性.如果能在农作物上应用则可以大大缩短研究周期，生产上更容易推广.此外，我们还观察到3-AB或BA处理在正常条件下不仅不会抑制拟南芥的生长，反而能增加拟南芥的生物量，对植物的正常生长无负面作用.

在正常条件下，PARP活性被抑制可以促进拟南芥的生物量增加的具体机制并不清楚，Schulz等[19,29]通过监测拟南芥的叶片生长趋势，以及对PARP抑制后拟南芥的转录组分析，发现抑制PARP活性增加了拟南芥叶片的细胞数目，推测可能是PARP被抑制后，促进了细胞周期进行，并影响植物的初级代谢和次级代谢过程，从而促进了植物的生长.另外，尽管环境胁迫对植物基因组的完整性及稳定性有一定影响，但在DNA损伤不严重时，激活PARP会消耗大量的ATP，对植物的生长是不利的.植物细胞由于其细胞壁的限制，不能自由移动，不会像动物细胞那样发生恶性转化，因此DNA损伤对植物整体造成的影响不如动物严重，植物对DNA损伤的耐受程度也比动物细胞要高很多.PARPs在拟南芥中并非正常生长所必须，其功能的缺失未对植物的正常生长造成影响(双突变正常条件下无表型)，这与动物中PARP缺失造成胚胎期致死完全不同.我们推测，在正常生长条件下或者仅有轻微DNA损伤的情况下，抑制拟南芥PARP的活性有利于能量的保存，使得植物能够更好地生长.这可能是我们观察到在正常生长条件下，抑制PARP活性后拟南芥的生长量发生增加的原因.

干旱是我国主要的自然灾害之一，它往往导致农作物的大规模减产，是影响作物生长、限制农业生产的重要环境因素.为了减小干旱年份作物产量的损失、合理利用有效的水资源，提高作物的抗旱性一直是农业科学研究的主要目标之一.科学家从抗旱节水作物品种的选育、抗旱节水转基因工程育种等入手来提高作物抗旱性[30]，这些都取得了很大进步，但是前期投入大，研究周期较长.在农业生产中，也有一些“植物抗旱剂”得到应用，主要基于保水材料的应用，或者基于植物对矿质元素、植物生长调节剂的需求而发展起来的[31]，这些都对改造作物的抗旱性做出了很大贡献，但其中有一些是通过影响激素途径来调节植物抗旱性的，则对植物的整体生长影响较大.本研究使用的3-AB或BA，作用于PARP的催化活性位点，对细胞中其他基因或者蛋白质的影响较小，不仅可以增强拟南芥抗旱性，还能促进植物的正常生长，因此在农业生产上具有作为抗旱剂使用的潜在价值.此外，3-AB是一种小分子量水溶性化学物质，容易配制、使用方便、用量小，但3-AB比BA的市售价更高，因此在使用抑制剂时也可用BA替代3-AB.BA易溶于水，价格低廉、使用方便、对植物副作用小，在土中仅需少量多次浇灌，就能起到明显促进抗旱的功能.在农业生产中如能应用，将带来一定经济价值.

[1]胡笳,郭燕婷，李艳梅.蛋白质翻译后修饰研究进展[J].科学通报,2005,50(11)： 1061-1072.

[2]TANUMA S, KAWASHIMA K, ENDO H. Comparison of ADP-ribosylation of chromosomal proteins between intact and broken cells[J].BiochemBiophysResCommun, 1985,127(3)： 896-902.

[3]AME J C, SPENLEHAUER C, de MURCIA G. The PARP superfamily[J].Bioessays, 2004,26(8)： 882-893.

[4]HUBER A, BAI P, de MURCIA J M,etal. PARP-1, PARP-2 and ATM in the DNA damage response： Functional synergy in mouse development[J].DNARepair(Amst), 2004,3(8-9)： 1103-1108.

[5]D′AMOURS D, DESNOYERS S, D’SILVA I,etal. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions[J].BiochemJ, 1999,342(Pt 2)： 249-268.

[6]SLADE D, DUNSTAN M S, BARKAUSKAITE E,etal. The structure and catalytic mechanism of a poly(ADP-ribose) glycohydrolase[J].Nature, 2011,477(7366)： 616-620.

[7]LI G, NASAR V, YANG Y,etal.Arabidopsispoly(ADP-ribose) glycohydrolase 1 is required for drought, osmotic and oxidative stress responses[J].PlantSci, 2011,180(2)： 283-291.

[8]VYAS S, CHESARONE-CATALDO M, TODOROVA T,etal. A systematic analysis of the PARP protein family identifies new functions critical for cell physiology[J].NatCommun, 2013,4(2240)： 1-13.

[9]AHEL D, HOREJSI Z, WIECHENS N,etal. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1[J].Science, 2009,325(5945)： 1240-1243.

[10]HEGANA D C, LUA Y, STACHELEKA G C,etal. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase downregulates BRCA1 and RAD51 in a pathway mediated by E2F4 and p130[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010,107(5)： 2201-2206.

[11]BOEHLER C, GAUTHIER L R, MORTUSEWICZ O,etal. Poly(ADP-ribose) polymerase 3(PARP3), a newcomer in cellular response to DNA damage and mitotic progression[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,108(7)： 2783-2788.

[12]KIM M Y, ZHANG T, KRAUS W L. Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1： ‘PAR-laying’NAD+into a nuclear signal[J].GenesDev, 2005,19(17)： 1951-1967.

[13]BABIYCHUK E, COTTRILL P B, STOROZHENKO S,etal. Higher plants possess two structurally different poly(ADP-ribose) polymerases[J].PlantJ, 1998,15(5)： 635-645.

[14]LAMB R S, CITARELLI M, TEOTIA S. Functions of the poly(ADP-ribose) polymerase superfamily in plants[J].CellMolLifeSci, 2012,69(2)： 175-189.

[15]OTTO H, RECHE P A, BAZAN F,etal. In silico characterization of the family of PARP-like poly(ADP-ribosyl) transferases(pARTs)[J].BMCGenomics, 2005,6(139)： 1-23.

[16]BRIGGS A G, BENT A F. Poly(ADP-ribosyl) ation in plants[J].TrendsPlantSci, 2011,16(7)： 372-380.

[17]BLOCK M D, VERDUYN C, BROUWER D D,etal. Poly(ADP-ribose) polymerase in plants affects energy homeostasis, cell death and stress tolerance[J].PlantJ, 2005,41(1)： 95-106.

[18]DOUCET-CHABEAUD G, GODON C, BRUTESCO C,etal. Ionising radiation induces the expression of PARP-1 and PARP-2 genes in Arabidopsis[J].MolGenetGenomics, 2001,265(6)： 954-963.

[19]SCHULZ P, NEUKERMANS J, KELEN K V D,etal. Chemical PARP inhibition enhances growth ofArabidopsisand reduces anthocyanin accumulation and the activation of stress protective mechanisms[J].PLoSONE, 2012,7(5)： e37287.

[20]ADAMS-PHILLIPS L, WAN J, TAN X,etal. Discovery of ADP-ribosylation and other plant defense pathway elements through expression profiling of four differentArabidopsis-PseudomonasR-avr interactions[J].MolPlantMicrobeInteract, 2008,21(5)： 646-657.

[21]VANDERAUWERA S, BLOCK M D, STEENE N V,etal. Silencing of poly(ADP-ribose) polymerase in plants alters abiotic stress signal transduction[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2010,104(38)： 15150-15155.

[22]BANASIK M, KOMURA H, SHIMOYAMA M,etal. Specific inhibitors of poly(ADP-ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl) transferase[J].JBiolChem, 1992,267(3)： 1569-1575.

[23]LANGELIER M F, SERVENT K M, ROGERS E E,etal. A third zinc-binding domain of human poly(ADP-ribose) polymerase-1 coordinates DNA-dependent enzyme activation[J].JBiolChem, 2008,283(7)： 4105-4114.

[24]张海磊，吴巧，葛晓春.拟南芥多聚ADP核糖聚合酶Ⅰ的原核表达与活性检测[J].西北植物学报,2014,34(5)： 866-872.

[25]张慧，汪沛洪.叶片相对含水量的活性测定[J].植物生理学通讯,1991,27(3)： 217-219.

[26]HASHIDA S N, TAKAHASHI H, UCHIMIYA H. The role of NAD biosynthesis in plant development and stress responses[J].AnnBot, 2009,103(6)： 819-824.

[27]BRYANT H E, SCHULTZ N, THOMAS H D,etal. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase[J].Nature, 2005,434(7035)： 913-917.

[28]MABLEY J G, SUAREZ-PINZON W L, Hasko G,etal. Inhibition of poly(ADP-ribose) synthetase by gene disruption or inhibition with 5-iodo-6-amino-1,2-benzopyrone protects mice from multiple-low-dose-streptozotocin-induced diabetes[J].BrJPharmacol, 2001,133(6)： 909-919.

[29]SCHULZ P, JANSSEUNE K, DEGENKOLBE T,etal. Poly(ADP-ribose)polymerase activity controls plant growth by promoting leaf cell number[J].PLoSOne, 2014,9(2)： e90322

[30]GUO C, GE X, MA H. The riceOsDILgene plays a role in drought tolerance at vegetative and reproductive stages[J].PlantMolBiol, 2013,82(3)： 239-253.

[31]张卫星，赵致，廖景容，等.作物抗旱剂的应用研究进展[J].中国农学通报,2004,20(6)： 334-339.

Application of Poly(ADP-ribose) Polymerases Inhibitors Improves the Drought Tolerance ofArabidopsisThaliana

LIU Caifeng1,2, WU Yin1,2, LIU Weiwei1,2, GE Xiaochun1,2

(1. School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

In order to study the physiological role of poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)invivo, we used PARP inhibitors to suppress the activities of PARPs by adding the inhibitors into soil or the culture media.Invitrobiochemical experiments showed that PARP inhibitor 3-AB can inhibit the catalysis activities of PARP1 and PARP2. Application of poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor 3-AB improved the drought tolerance ofArabidopsis. The 3-AB treated seedlings retained more water in leaves and recovered better than control plants after drought stress. Another inhibitor BA also showed the similar effects as 3-AB. Under normal conditions, application of 3-AB or BA also increased the fresh weight ofArabidopsis. These results suggested that inhibition of PARP activities can improveArabidopsisdrought tolerance.

Arabidopsisthaliana; poly(ADP-ribose) polymerase; 3-AB; BA; drought tolerance

0427-7104(2016)01-0074-08

2015-03-30

国家自然科学基金(31070232, 31170169)

刘财丰(1985—)，女，硕士研究生；葛晓春，女，教授，通讯联系人，E-mail： xcge@fudan.edu.cn.

Q 946.1

A