大肠埃希菌ELISA检测条件的优化

白　羽，宋见喜，庄　严，安丽萍，杜培革，徐广宇，

（1.吉林医药学院药学院，吉林吉林　132013；2.北华大学药学院，吉林吉林　132013）

大肠埃希菌ELISA检测条件的优化

白羽1，宋见喜2，庄严2，安丽萍2，杜培革2，徐广宇1，2

（1.吉林医药学院药学院，吉林吉林132013；2.北华大学药学院，吉林吉林132013）

目的对ELISA检测大肠埃希菌方法条件进行优化研究.方法以大肠埃希菌为对象，通过Box-Behnken设计星点响应面实验进行优化实验.结果优化后ELISA检测条件:抗原包被浓度为6.25μg/mL，抗原包被最佳时间为7 h，抗体稀释度最佳为1∶625 0，大肠埃希菌ELISA检测OD值为2.12.结论经实验得证，通过星点响应面实验方法进行大肠埃希菌ELISA检测条件优化，结果合理有效，优化效果良好.

大肠埃希菌；ELISA检测；优化

【引用格式】白羽，宋见喜，庄严，等.大肠埃希菌ELISA检测条件的优化［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）:359-362.

据WHO的2010年最新报告，全球每天约有3万人死于感染性腹泻［1-2］，其中大部分是由大肠埃希菌的污染导致［3-5］，因此，对大肠埃希菌的快速筛查和高灵敏检测的要求备受关注［6-7］.

免疫分析（immunoassay，IA）是通过抗体进行标记，利用标记物的生理作用来进行工作［8］.由于其对技术要求较低，操作快速准确，在病原微生物的快速监测中显示出独特优势［8］.其中酶联免疫分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）在各种检测中使用最多［9-11］.在ELISA的具体检测中面临很多问题，其中最大的问题就是灵敏度和特异性受到影响.因此，在免疫分析建立过程中对方法进行条件优化，增加检测的灵敏度，快速准确筛查病原微生物.响应面优化实验则能够对多因素多水平筛选最优条件，获得理想的结果［12-14］.本文通过设计星点Box-Behnken响应面实验，以大肠埃希菌为对象，对ELISA检测大肠埃希菌方法条件进行了优化研究.

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌种

大肠埃希菌O157H7株均由北华大学药学院实验室保存并提供.

1.1.2培养基

LB培养基:1 000 mL含10 g水解酪蛋白（OXOID产品），3 g酵母粉（OXOID产品），8.5 g NaCl，用NaOH或HCl调pH至7.0.

1.2实验方法

1.2.1ELISA检测

本研究所用抗体的蛋白质含量为5μg/mL左右，如果浓度检测结果高于此值，应在实验前进行稀释.将实验用抗体滴加到每个实验反应孔中，每个实验反应孔加0.08mL，保存到4℃冰箱中12 h. 12 h后洗涤3次，150 s/次.将所要检测的样品加入之前的实验反应孔中，于37℃反应1 h，洗涤2次.再加入新鲜的酶标抗体0.1mL，37℃反应1 h，再洗涤1次.最后加入TMB实验用反应液，在37℃条件下反应0.5 h，加入终止反应液H2SO4，在波长450 nm处读取其吸收值［15］.

1.2.2星点设计

本研究根据星点设计原理，利用 Design-Expert.8.05b软件，通过ELISA检测大肠埃希菌方法条件:抗原包被浓度（因素A）、抗原包被时间（因素B）、抗体稀释度（因素C）进行了优化试验.本试验采用三因素三水平对检测条件进行优化，因素水平见表1，并对所得数据进行二次回归拟合，求得回归方程.

表1　试验因素水平编码Tab.1　Level and code of test factors

2　结果与分析

2.1ELISA响应面优化实验设计

本研究根据星点实验设计，对影响大肠埃希菌ELISA检测条件进行优化.实验结果见表2.

表2　响应面法设计方案及试验结果Tab.2　Experimental design and result of response surfacemethodology

对模型进行方差分析，结果见表3.由表3可以看出:模型的P＜0.001，表明模型高度显著，调整确定系数R2=94.92.

表3　响应面二次回归方程方差分析Tab.3　Variance analysis of response surface quadratic regression

由表3可知:因素A和C对大肠埃希菌ELISA检测影响显著，而B对大肠埃希菌ELISA检测影响不显著；因素A2和C2对大肠埃希菌ELISA检测影响其曲面效应显著，而对大肠埃希菌ELISA检测影响曲面效应不显著；因素AC和BC对大肠埃希菌ELISA检测影响比较显著，因素AB对大肠埃希菌ELISA检测影响效应不显著.

我们又通过统计分析软件对以上响应面实验结果进行了科学分析，结果见图1～3.从图1～3中可以直接看出:其中两两影响条件的交互作用是否互相影响，圆形（见图1）表示两两影响条件互相作用不显著，而椭圆形（见图2～3）则表示两两影响条件互相作用显著.

我们通过响应面法对抗原包被浓度（因素A）、抗原包被时间（因素B）、抗体稀释度（因素C）进行分析发现:在图1中，在抗体稀释度为最佳（1∶625 0）时，抗原包被浓度与抗原包被时间这两个影响因素之间的影响不显著.图2显示了在抗原包被时间为最佳（7 h）时，抗原包被浓度与抗体稀释度对大肠埃希菌ELISA检测产生影响效应，其等高线图的中心基本在图2的中心，因此，这两因素相互间影响比较显著，在实验中对这两个因素的优化调节要更具体、仔细.同时由图2可知:抗原包被浓度与抗体稀释度都很高时大肠埃希菌ELISA检测敏感，都低时ELISA检测敏感较低.因此我们需要在实验水平可调的范围内，适当调节抗原包被浓度与抗原包被时间.由图3可知:在抗原包被浓度为6.25μg/mL时，抗原包被时间与抗体稀释度对大肠埃希菌ELISA检测存在影响效应，并且作用显著.

综上所述，回归模型存在最大值，即在抗原包被浓度6.25μg/mL、抗原包被最佳时间为7 h、抗体稀释度为最佳1∶625 0的条件下，大肠埃希菌ELISA检测OD值最大值为2.12.

2.2重复性实验验证

在优化后的大肠埃希菌ELISA检测条件下我们又做了5组重复实验，所得大肠埃希菌ELISA检测OD值分别为2.10，2.11，2.10，2.10，2.09，平均值为2.10.通过软件所得的预测值为2.12，与验证试验的平均值2.10非常接近，证明应用响应面法优化大肠埃希菌ELISA检测条件可行.

3　结　论

利用 Design-Expert.8.05b等软件，通过 Box-Behnken响应面设计法对大肠埃希菌ELISA检测条件进行了优化，以及对该模型进行了显著性检验，探讨了抗原包被浓度、抗原包被时间、抗体稀释度之间的交互作用，从而得到优化条件.优化后得到的检测条件为抗原包被浓度为6.25μg/mL，抗原包被时间为7 h，抗体稀释度为1∶625 0.在优化后的条件下，大肠埃希菌ELISA检测的灵敏度明显提高.经实验得证，通过星点响应面实验方法进行大肠埃希菌ELISA检测条件优化，结果合理有效，优化效果良好.

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【责任编辑：陈丽华】

Optimization of ELISA Conditions for Escherichia Coli Detection

Bai Yu1，Song Jianxi2，Zhuang Yan2，An Liping2，Du Peige2，Xu Guangyu1，2
（1.Pharmacy College of Jilin Medical College，Jilin 132013，China；2.Pharmacy College of Beihua University，Jilin 132013，China）

Objective To optimize the test conditions of ELISA method for detecting E. coli. Method The ELISA method for detecting E. coli was optimized through Box-Behnken central composite design and response surface methodology.Results The optimized ELISA test conditions were as follows: antigen coating concentration of 6.25 μg /mL antigen coating time of 7 hours，antibody dilution of 1 ∶ 625 0.Under this condition，the detected OD value of E.coli reached 2.12.Conclusion The optimization of ELISA conditions for E.coli detection using the Box-Behnken statistical experimental design is not only scientific and rational，but also quick and efficient.

Escherichia coli；ELISA detection；optimization

R378

A

1009-4822（2016）03-0359-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.017

2015-07-12

吉林省教育厅科学技术研究项目（2014505；2014546）；大学生创新项目（201510201106）.

白羽（1980-），女，博士，讲师，主要从事药物分析研究，E-mail:baiyu218@163.com；通信作者:徐广宇（1980-），男，博士，副教授，主要从事微生物与生化药学方面研究，E-mail:xuguangyu2005@163.com.