人心肌脂肪酸结合蛋白胶体金快速检测试剂条的研制*

郑　杰，龚　成，赵肃清

(广东工业大学轻工化工学院制药工程系，广东　广州　510006)



人心肌脂肪酸结合蛋白胶体金快速检测试剂条的研制*

郑杰，龚成，赵肃清

(广东工业大学轻工化工学院制药工程系，广东广州510006)

建立一种以胶体金为基础的心肌脂肪酸结合蛋白质(H-FAB)免疫层析快速检测方法。方法 以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析试纸条，并对其特异性、灵敏度以及临床应用进行评价。最低检出限为10 ng·mL-1；10 min内即可观察结果；检测急性心肌梗塞(AMI)患者46例、正常人群85例，试纸条的敏感度为86.96%，特异度为97.65%，约登指数为0.8461，kappa值为0.8633，表明试纸条与临床确定的结果几乎一致。该方法方便、快捷，能有效的检测H-FAB，胶体金免疫层析试纸的研制为心肌梗塞的快速诊断与筛查奠定了基础。

心肌脂肪酸结合蛋白质；胶体金免疫层析；试纸条

急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)是由于冠状动脉急性阻塞引起严重和持久的心肌缺血坏死，如不及时救治，极易导致死亡[1]。心肌脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein，H-FABP)是AMI早期新型高敏性标志物[2-3]。本研究采用胶体金免疫层析[4]与双抗体夹心的原理，通过原料筛选和工艺探索，研制H-FABP快速检测试剂，并进行临床对照试验，为急性心肌梗塞提供早期诊断和筛查依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

H-FABP单克隆抗体,课题组制备；抗H-FABP单克隆抗体抗体,购于Fitzgerald；羊抗兔IgG,购于上海杰一生物技术有限公司；柠檬酸钠、氯金酸、ProClin 300,购于Sigma；BSA,购于默克；其他试剂均为国产分析纯。玻璃纤维素垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、PVC板、吸水垫、胶体金聚酯结合垫、抽提管等耗材,购于上海杰一生物技术有限公司。

1.2仪器与设备

HM3030三维平面点膜喷金仪，上海金标生物科技有限公司；C6M切割机，韩感中国；GZX-9140MBE电热鼓风干燥机，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；5417R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；U3010紫外可见光谱仪，日本HITACHI公司；HDM-2000调温恒温电热套，常州国华电器有限公司；Tecnai12透射电子显微镜，荷兰FEI。

1.3方法

1.3.1检测原理

采用双抗体夹心法和胶体金免疫层析的原理。将待测样本加入到样品孔，流经结合垫时与胶体金标记的抗H-FABP单克隆抗体反应。此混合物流向包被有另一株抗H-FABP单克隆抗体的NC膜时与之反应并形成“抗体-抗原-抗体-胶体金”复合物。阳性时，在膜上显现出红色检测线(T)。当样本为阴性或者检测抗原浓度低于本产品灵敏度时，T线不显示。在检测线上方的包被有羊抗兔IgG二抗，捕获胶体金结合物并形成质控线(C)，即此试剂有效。

图1　双抗体夹心胶体金原理

1.3.2胶体金免疫层析试纸条的研制

1.3.2.1胶体金颗粒的制备与鉴定

采用柠檬酸三钠还原氯金酸法：取纯水100 mL加热至约80～90 ℃；加入1%氯金酸溶液1 mL，继续加热搅拌至沸腾；迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液2 mL；加速搅拌继续煮沸约5 min，待溶液变成透明红色后停止加热，适当速度搅拌至室温，去离子水定容至100 mL，4 ℃保存备用。胶体金通过紫外扫描光谱仪和透射电镜进行表征[5]。

1.3.2.2胶体金标记抗体的制备

取1 mL胶体金溶液，用0.2 mol/L K2CO3溶液调节pH至8.5。加入0.01 mg抗H-FABP单克隆抗体抗体，轻微震荡混匀，室温下静置1 h。再逐滴加入10 iL 10%的 BSA，充分混匀后静置10 min，4 ℃，12000 r/min离心15 min，弃上清，加入0.01 mL含0.1% BSA，0.01% ProClin 300 pH8.5的0.05 mol/L Tris-HCl溶液使金-抗体复合物重悬，4 ℃保存备用。标记抗体通过紫外扫描光谱仪检测。

1.3.2.3样品垫的预处理

用含1% BSA、2.5%蔗糖、0.5% Triton-100、0.5% PVP、0.2%酪蛋白钠盐、0.01%ProClin300的pH 7.4，0.01 mol/L PBS溶液浸泡玻璃纤维样品垫，室温干燥12 h后备用。

1.3.2.4检测线、质控线的包被

将包被抗体和羊抗鼠IgG分别稀释至2.5、1.5 mg/mL，用点膜仪以1 μL/cm喷于NC膜上，分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，37 ℃干燥24 h备用。

1.3.2.5试纸条的组装

以PVC板作背衬，将玻璃纤维素样品垫、胶体金聚酯结合垫、NC膜和吸水垫如图1所示组合，用切割机切成4 mm宽的纸条，装入卡壳内。

1.3.3试纸条性能检测

1.3.3.1试纸条的最低检出限测试

将重组H-FABP抗原用PBS稀释至浓度为200、100、50、10、5、0 ng/mL，将胶体金试纸条插入到系列浓度溶液中，观察检测结果。

1.3.3.2试纸条交叉反应测试

将试纸条插入到H-FABP抗原、牛血清、猪血清、鼠血清中进行检测，观察检测结果。

1.3.3.3试纸条的稳定性实验

试剂在37 ℃条件下放置20 d后进测试，观察测试结果。

1.3.4临床样本检测

在三家医院采集85例体检健康人群(肝、肾功能正常、心肌酶谱、心电图正常)的血液；46名AMI患者入院后立即采血，血液样本4 ℃，3000 rpm离心10 min收集血清。采用研制的胶体金试纸条进行检测，计算灵敏度，特异度，约登指数以及Kappa值。

2　结　果

2.1胶体金免疫层析试纸条的研制

本研究所制备的胶体金颗粒的最大特征吸收峰在520 nm处，峰形光滑，峰宽较窄，偶联抗体后的胶体金紫外光谱最大吸收峰红移，说明抗体已偶联到胶体金颗粒上(图2)。从扫描电镜图显示，胶体金颗粒大小较均匀，平均粒径约20 nm(图3)。

图2　胶体金溶液的紫外扫描光谱

图3　胶体金颗粒透射电镜图

2.2试纸性能测试

2.2.1试纸条最低检出限测试

通过所制试纸条对不同浓度的H-FABP抗原进行检测，10 ng/mL以上可以检测出，因此将该试纸条的灵敏度定为10 ng/mL(图4)。

图4　胶体金试纸条灵敏度的检测

2.2.2试纸条交叉反应测试

试纸条检测H-FABP抗原呈阳性，检测牛血清、猪血清、鼠血清均呈阴性，证实试纸条特异性良好(图5)。

图5　胶体金试纸条特异性的检测

2.2.3试纸条的稳定性实验

将所制备的试纸条用铝箔袋封好后放入37 ℃烘箱20天后，对试纸条的灵敏度以及特异性进行测定，测定结果显示灵敏度有轻微的下降，特异性保持良好，证明试纸条有良好的稳定性。

2.3临床样品检测

用所制备胶体金试纸条共检测临床样本131例，(正常人群85例，AMI患者46例)，结果见表1。计算公式：计算公式：灵敏度=a/(a+c)×100%，特异度=d/(b+d)×100%，约登

指数=[a/(a+c)+d/(b+d)]-1，Kappa=2(ad-bc)/[(a+b)(b+d)+(a+c)(c+d)]。通过计算得出试纸条检测的敏感度为86.96%，特异度为97.65%，约登指数为0.8461，kappa值为0.8633，表明试纸条检测与临床确定的结果几乎一致。

表1　胶体金试纸条测定临床样本

3　结　论

AMI是最主要的一种心血管疾病，日益严重危害着人们的生命健康，临床结果表明患者在AMI发生6 h内进行再灌注治疗会大大减少死亡率，H-FABP作为AMI早期标志物，其快速检测有着重要意义。常用的ELISA法、连续置换免疫测定等检测方法，能定量检测H-FABP，但检测时间长(>1 h)、需要特殊的仪器、操作复杂、不能单份测定，不适宜床边和急诊室的快速检测。

本研究采用胶体金免疫层析技术研制出H-FABP定性检测试纸条，每份标本只需10 min即可肉眼判读结果，试剂条快速、简便、准确的特点，具备了在广大基层医院和急诊室应用的条件，为急性心肌梗塞患者的临床快速诊断和现场应用提供了一种简便、快捷的诊断方法。

[1]White H D, Chew D P. Acute myocardial infarction [J]. The Lancet, 2008, 372: 570-584.

[2]Watanabe K, Wakabayashi H, Veerkamp J H, Ono T, Suzuki T. Immunohistochemical distribution of heart-type fatty acid-binding protein immunoreactivity in normal human tissues and in acute myocardial infarct [J]. The Journal of pathology, 1993, 170(1): 59-65.

[3]Azzazy H M E, Pelsers M M A L, Christenson R H. Unbound free fatty acids and heart-type fatty acid-binding protein: diagnostic assays and clinical applications[J]. Clinical chemistry, 2006, 52(1): 19-29.

[4]汪琳,周琦,赖平安,等. 免疫胶体金技术及其在检验检疫中的应用[J]. 检验检疫科学，2004(04):56-58.

[5]李卫玲,叶阳,周有祥,等. 柠檬酸三钠法制备胶体金的工艺条件优化[J]. 湖北农业科学, 2010(10):2529-2532.

Development of Colloidal Gold Rapid Test Strip for Human Heart Type Fatty Acid-binding Protein*

ZHENGJie,GONGCheng,ZHAOSu-qing

(Department of Pharmacy Engineering, School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology，Guangdong Guangzhou 510006，China)

To establish a rapid method of detecting human heart type fatty acid-binding protein (H-FABP) of acute myocardial infarction (AMI) patients, a rapid test strip of H-FABP was developed by using the gold-based immune chromatographic assay (GICA) technology. Based on the principle of double-antibody sandwich method, the colloidal gold strip was developed. The specificity, sensitivity and clinical application were evaluated. Results showed that the lowest detection limit of assay was 10 ng·mL-1and the detection time was about 10 min. The results of clinical detection of 46 patients with myocardial infarction (AMI) and 85 normal people showed that the sensitivity and the specificity of the strip were 86.96% and 97.65%, respectively, Youden’s index and Kappa value were 0.8461 and 0.8633, respectively. There was no difference between the strip tests and clinical diagnosis results. This method was convenient, rapid and effective for the detection of H-FAB. The development of GICA was applicable and laid a solid foundation for the rapid determination and screening of AMI in clinics.

human heart fatty acid-binding protein; colloidal gold; rapid test; reagent strips

广东省自然科学基金项目(No: S2013010016021)。

郑杰(1975-)，男，博士，讲师，研究方向为免疫检测方法研究及制药工程。

TQ914.1

B

1001-9677(2016)03-0046-03