锁核酸探针多重荧光PCR快速检测肉制品中4种动物肉掺假的研究

许如苏　周广彪魏霜　段建发　刘中勇　陈冠武

（汕头出入境检验检疫局　广东汕头　515031）

锁核酸探针多重荧光PCR快速检测肉制品中4种动物肉掺假的研究

许如苏周广彪*魏霜段建发刘中勇陈冠武

（汕头出入境检验检疫局广东汕头515031）

应用锁核酸探针技术建立同时检测肉制品中牛、猪、鸡、鸭4种动物肉掺假的方法。针对动物线粒体基因组的保守序列，设计特异性引物和Taqman-LNA探针，建立同时检测肉制品中牛、猪、鸡、鸭源性成分的多重Taqman-LNA荧光PCR方法，用于市售肉制品的检测，同时采用标准方法进行验证。结果显示，建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法可同时检测肉制品中上述动物源性成分，检测限均达到肉含量的0.01%。将样品Ct≤30，且｜样品Ct-纯肉Ct｜≤7判为肉掺假；将样品Ct≤30，且｜样品Ct-纯肉Ct｜＞7判为肉污染。对200份市售肉制品检测发现，有42份样品掺入标签标示以外肉种，有22份样品存在肉污染，其中2份样品暨掺假又污染。多重方法对肉源性成分的检测结果与现行标准方法符合率达99%。本研究建立的方法可同时检测肉制品中牛、猪、鸡、鸭4种动物源性成分，具有特异、快速、经济、高通量等优点，设定的肉掺假和肉污染判定标准合理，可有效避免肉污染导致的掺假误判。

动物源性成分；掺假；锁核酸探针；多重Taqman-LNA荧光PCR；肉制品

1　前言

因利益驱使，导致肉制品“掺假使假”事件频发。2013年欧洲马肉丑闻席卷了瑞典、英国、法国等多个国家，引起国际关注；在国内，肉制品“掺假使假”时有报道，常见用猪肉、鸭肉等低价位肉掺入甚至代替高价位的牛羊肉［1，2］，并出现多肉种掺假趋势［3］。打击肉制品掺假已成为肉制品监管的一项重要任务，因此急需解决肉种的高通量快速鉴别。

关于肉种鉴别已有很多研究报道，有基于蛋白质的ELISA方法和基于核苷酸序列的分子生物学方法。其中，PCR技术以稳定、准确、快速等优势而得到广泛应用［4-6］，并逐步成为肉种鉴别的标准方法［7-9］。但除了SN/T 2051-2008及SN/T 2980-2011采用多重实时PCR法同时检测不同肉种外，其他标准均为单一肉种检测，显然，现行标准方法尚难以满足肉制品打假的高通量快速鉴别需要。此外，现行标准［7，8］多数采用Ct≤35作为阳性判定标准，达到痕量检测水平，然而肉制品生产、加工、销售过程无法完全避免肉污染，因此存在因肉污染引起掺杂误判导致执法纠纷的可能。

本研究利用Taqman-LNA荧光探针可提升Tm值和杂交的特异性［10］，增加探针设计灵活性［11］等优点，建立同时检测肉制品中的牛、猪、鸡、鸭成分的多重Taqman-LNA荧光PCR方法，实现高通量快速筛查，为打击肉制品掺假使假提供高效检测手段，并且通过合理设置掺假检测限，可排除肉污染引起的掺假误判。

2　材料与方法

2.1材料

2.1.1样品

肉制品购自农贸市场和超市，详见表1。

表1　样品信息

2.1.2仪器

荧光定量PCR仪（LightCycler®480）：Roche公司；高速离心机：Beckman公司；恒温干热器：Eppendorf公司。

2.1.3试剂

Probes Master 2×conc.：购自Roche公司；核酸提取（离心柱法）试剂盒：购自达安公司。

2.2方法

2.2.1DNA提取

参照文献［12］进行。

2.2.2引物探针的设计与合成标记

从GenBank上查找并下载牛、猪、鸡、鸭线粒体基因组全序列，并参考近5年文献发表的相关序列，使用ClustalX软件进行序列比对，筛选出种属相关的保守序列，使用Primer Express软件设计引物探针，交上海辉睿生物科技有限公司合成。序列见表2。

表2　引物探针序列

2.2.3多重Taqman-LNA荧光PCR方法的建立

先将引物和探针分组配对，分别建立检测牛、猪、鸡、鸭的单重Taqman-LNA荧光PCR方法。在此基础上组建多重方法，通过优化各引物探针浓度和退火温度并建立颜色补偿曲线，减少相邻荧光通道的干扰，最后确定多重方法的反应体系为25 μL，其中Probes Master 2×conc.溶液12.5 μL，牛、猪、鸡、鸭的引物终浓度分别为0.6 μmol/L、0.6 μmol/L、0.3 μmol/L、0.8 μmol/L，探针终浓度分别为0.3 μmol/L、0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4 μmol/L，DNA模板2 μL。反应条件为95℃ 8 min，95℃ 8 s，59℃ 25 s；40个循环。

2.2.4掺假与污染阈值确定

在制备纯牛肉样本后将制样设备简单冲洗处理，再制备猪肉样本，模拟肉污染样本5份；另在制备纯牛肉样本后彻底清洁设备，精确制备含量为99%猪肉+1%牛肉的混合样本5份；将上述样本各自提取并检测牛源性成分，设2次重复试验，分析纯牛肉、人为掺杂1%牛肉与模拟污染样品的检测结果。

采集继加工牛肉丸后加工的猪肉丸 （疑似污染样品）5份，检测牛源性成分，分析检测结果。

基于对模拟肉污染和对实际生产线的调查，以及方法的检测限、掺假目的和方便判定考量，确定掺假和污染判定阈值。

2.2.5对市售肉制品的检测及与标准方法的比较

用多重方法对市售肉制品进行检测，同时采用SN/T 2051-2008、SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013对样品进行检测验证。

表3　多重Taqman-LNA荧光PCR方法敏感性试验结果

3　结果

3.1特异性试验

与马、牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、驴、鹿、兔、虾等动物源性DNA试验结果，多重方法和单重方法的特异性一致，相应通道仅与对应的肉种出现特异性扩增，与其他肉种无典型扩增。

扩增产物经送上海辉睿生物科技有限公司测序，结果与预期相符。

3.2敏感性试验

牛、猪、鸡、鸭单重方法的检测限为0.01%-0.001%；多重方法的检测限与单重方法一致或低1个数量级，但仍可检测到肉含量的0.01%。结果详见表3，多重方法的敏感性试验扩增曲线和标准曲线分别见图1和图2。

图1　多重Taqman-LNA荧光PCR敏感试验扩增曲线

图2　多重Taqman-LNA荧光PCR标准曲线

3.3掺假和加工污染阈值的确定

纯牛肉、1%牛肉、模拟污染样品和疑似污染样品的检测结果见表4。

表4　掺杂与污染样品牛源性成分检测结果

按照现行检测标准进行判定，表4中的模拟污染样品和疑似污染样品均可判为掺假。虽然按标准曲线推算，其肉含量不足0.01%，显然为肉污染引起的掺假误判。为避免该类误判发生，基于上述数据分析、线性方程定量结果，考量掺杂利益需求情况，在方便判定的原则下，将样品Ct≤30，有典型扩增曲线，且|样品Ct-纯肉Ct|≤7判为肉掺假；将样品Ct≤30，有典型扩增曲线，且|样品Ct-纯肉Ct|＞7判为肉污染。

3.4对市售样品的检测结果及与标准方法检测符合性比较

用多重方法共检测市售样品200份，检出肉种成分与标签标示成分不符样品62份，样品不合格率为31%。其中掺假42份，掺假率为21%，掺假成分为猪肉20份，鸭肉20份，同时掺入猪、鸡、鸭肉2份；检出肉污染22份，污染率为11%，其中污染鸭肉14份，鸡肉4份，牛肉2份，猪肉2份；有2份样品既掺假又有污染。从肉种看，掺假率较高的样品为羊肉制品、牛肉制品和多肉种制品；从加工方式看，掺假率较高的样品为丸类制品、调味较重的肉串和五香麻辣制品；从样品来源看，农贸市场和超市销售的样品掺假率较高，而餐饮店相对较低。

采用SN/T 2051-2008、SN/T 2978-2011和SN/ T 3731.5-2013对本次抽取的200份市售肉及肉制品进行相应肉种检测。其中采用SN/T 2051-2008 对200份样品的牛、猪源性成分的检测结果与多重方法对牛、猪源性成分的检测结果完全相符，SN/T 2978-2011对样品的鸡源性成分的检测结果与多重方法的检测结果也完全相符，SN/T 3731.5-2013对样品的鸭源性成分的检测结果与多重方法的检测结果99%相符，只有香酥牛肉丁和麻辣牛肉各1份检测结果不符，为多重方法检出鸭源性成分污染，而SN/T 3731.5-2013未检出鸭源性成分。

4　讨论

目前用于动物源性成分检测的PCR方法都相当敏感，DNA检测的灵敏度达到了pg级［6，13］，相当于含肉量的0.01%，甚至达到含肉量的0.001%。对于动物源性成分检测研究以及检测标准多采用方法的检测限，以Ct≤35［6，8］，甚至以Ct＜40［14］作为判定标准。然而，由于肉及肉制品在加工、销售过程存在肉污染风险而易引发掺假误判。本研究采用SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013对市售肉制品检测发现，一些产品的检测结果30＜Ct＜35，与纯肉阳性对照相差8个循环以上，但按标准仍判为阳性。而按线性方程推算，阳性成分含肉量低于0.1%，甚至0.01%，这样的人为掺假显然不存在。为解决掺假误判问题，本研究基于肉含量在100%-0.1%时，其DNA含量与Ct值呈现良好的线性关系，100%肉与1%肉的DNA含量的Ct值理论上相差7左右，而掺假肉类的含量低于1%没有经济效益的考虑，将|样品Ct-纯肉Ct|≤7作为掺假检测项，使方法更具实用性。

以多重PCR为基础的肉类成分鉴别技术，具有检测通量高、快速且节省检测费用等优点，但由于其需要在同一PCR体系里加入多对特异性引物和探针，复杂的PCR体系易造成方法灵敏度降低，对不同目标序列扩增效率不一致和相邻荧光通道的干扰，从而使得相关方法的推广与标准化受到限制。本研究利用荧光PCR和LNA探针的优点，设计了序列较短，扩增目的产物较小，长度为100 bp左右，但特异性强的引物探针，最大限度减少了不同引物探针对间的相互干扰，降低肉品加工过程加热、加压等处理对PCR扩增反应的影响。

如采用PCR仪（Roche，LightCycler®480）进行检测，尚需建立颜色补偿曲线，消除相邻荧光通道的荧光干扰，方可同时检测肉制品中的牛、猪、鸡、鸭等4种动物成分；如采用PCR仪（BIO-RAID，CFX96）进行检测，则相邻通道不存在荧光干扰，建立的多重方法敏感度与单重无差别，可直接同时检测肉制品中的牛、猪、鸡、鸭等4种动物成分。与何玮玲等［15］应用多重 PCR同时鉴定猪、牛、羊、鸡相比，本多重方法可免去电泳，无需触毒，可疑样品无需酶切和测序等确证实验，操作更简便，也更快速、安全。与现行标准方法相比，本多重方法大大提高了检测效率，降低检测成本。

对市售肉制品检测发现，鸭肉和猪肉是主要的掺假肉种，国内一些大品牌产品，同样存在掺假行为。一些商家钻了标签标准的空子，对于多肉种的肉制品，往往以高价肉作为品名，而实际却以低价肉为主，这应引起监管部门和标准制定者的重视。建议在对标签标准修订时，应明确标签需列明肉种及其含量，并仅限以主肉种作为品名，避免误导消费者。

5　结论

本研究选用线粒体的保守序列设计特异性引物和Taqman-LNA探针，建立的多重Taqman-LNA荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性，设置的掺假检测限符合肉制品掺假实际，可避免肉制品生产、加工过程中无意的肉污染引起的掺假误判。本方法适用于肉制品掺假的快速检测，具有操作简便、快速、经济、高通量等优点。

［1］郭凤柳，熊蕊，刘晓慧，等.应用PCR技术检测掺假肉类［J］.食品安全质量检测学报，2014，5（2）：541-545.

［2］金萍，丁洪流，李培，等.2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查［J］.中国食品卫生杂志，2014，26（2）：168-172.

［3］吴国颂.珠海6家农贸市场"肥羊"掺假鸭肉马肉凑数［EB/OL］. http：//www.chinadaily.com.cn/hqgj/jryw/2014-01-13/content_ 11021566.html.

［4］Matsunaga T，Chikuni K，Tanabe R，et al.A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay［J］.Meat Science，1999，51（2）：143-148.

［5］ Chisholm J，Conyers C，Booth C，et al.The detection of horse and donkey using real-time PCR［J］.Meat Science，2005，70 （4）：727-732.

［6］ Chun-LaiZhang，MarkR.Fowler，NigelW，etal.Scotta taqmanrealtimePCRsystemfortheidentificationand quantification of bovine DNA in meats，milks and cheeses［J］. Food Control，2007，18：1149-1158.

［7］SN/T 3731.5-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第5部分：鸭成分检测 PCR法［S］.

［8］SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法［S］.

［9］SN/T 2978-2011动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法［S］.

［10］王清，伦立民，王丽华，等.Taqman锁核酸探针实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA［C］.青岛市分析测试学会论文集（2011-2-22）.

［11］李生茂，徐祥，梁华平，等.锁核酸研究进展［J］.生理科学进展，2003，34（4）：319-323.

［12］许如苏，周广彪，魏霜，等.锁核酸探针技术快速检测鸭源性成分的研究［J］.中国兽医杂志，2015，51（9）：91-93.

［13］周彤，李家鹏，田寒友，等.一种基于实时荧光聚合酶链式反应的肉及肉制品中猪源性成分含量测定 ［J］.肉类研究，2013，27 （12）：11-15.

［14］SN/T 2727-2010饲料中禽源性成分检测方法 实时荧光PCR方法［S］.

［15］何玮玲，张驰，杨静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法［J］.中国农业科学，2012，45（9）：1873-1880.

Development of Multiplex Taqman-LNA Real-time PCR for Rapid Detecting Four Meat Adulteration in Meat and Meat Products

XU Rusu，ZHOU Guangbiao*，WEI Shuang，DUAN Jianfa，LIU Zhongyong，CHEN Guanwu
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong，515031）

To develop a multiplex taqman-LNA real-time PCR for the rapid detection of bovine，pork，chickenandduckadulterationinmeatandproductssimultaneously，species-specificprimersand taqman-LNA probes were designed based on the COI gene sequence of bovine，pork，chicken and duck.A multiplex taqman-LNA real-time PCR was developed for the rapid detection of the animals-derived ingredients in meat and products after optimization of the reaction conditions.The assay and standard method were simultaneously used to detect 200 samples from markets.The results showed that the assay coulddetect0.01%eachtargetmeatoffourmeatfromtheaboveanimalsinmeatproducts simultaneously.There was positive of adulteration for sample with the result|Ct（sample）-Ct（meat）|≤7，and positive of pollution for sample with the result|Ct（sample）-Ct（meat）|＞7&Ct（sample）≤30.42 of 200 samples from markets were found adulteration，21 of 200 meat products were found pollution by other meat.The results for detecting the samples by the assay were 99%consistent with the results of the standard methods.The assay was economic，high-throughput，rapid and specific，fit to detect bovine，pork，chicken and duck adulteration in meat and meat products simultaneously.There was a rational criterion for the result to avoid mistaking contamination to adulteration of meat effectively.

Aminal-DerivedIngredients；Adulteration；LockedNucleicAcidProbe；Multiplex taqman-LNA PCR；Meat and Products

TS207.3

E-mail：xurs64@126.com；*通讯作者E-mail：312480317@qq.com

广东出入境检验检疫局科技计划项目（2014GDK24）

2015-10-20