葡萄柚籽提取物（GSE）对醪糟保藏期的影响及其菌群变化的工艺研究

姚宇晨，吕　欣，周　元，梁名伟，王振猛，杜若曦，叶　萌，刘变芳

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌　712100）



葡萄柚籽提取物（GSE）对醪糟保藏期的影响及其菌群变化的工艺研究

姚宇晨，吕欣，周元，梁名伟，王振猛，杜若曦，叶萌，*刘变芳

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

醪糟是一种营养丰富、口感独特的风味食品，葡萄柚籽提取物是潜在的广谱性细菌、真菌杀菌剂，在食品保鲜中具有较好的效果。为了探究在醪糟低温保藏的过程中加入葡萄柚籽提取物（Grapefruit seed extract，GSE）后产品菌群及各项指标变化，试验通过检测醪糟保藏过程中细菌总数、酵母菌、霉菌等微生物指标，酸度、糖度等理化指标和感官评定的方法，研究葡萄柚籽提取物对醪糟饮品的保鲜功能，以期为开发新型植物源的食品防腐剂提供理论依据。

醪糟；葡萄柚籽提取物；微生物；保鲜

醪糟是我国传统的大米发酵制品，具有口味鲜美、营养价值丰富等特点。醪糟中除含有水、乙醇和糖外，还含有多种有机酸、蛋白质、氨基酸和多肽等易被人体消化吸收的营养物质［1］，长期食用可强身健体、活血通脉、防病驱寒，其淀粉降解产物含有丰富的麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖，具有较强的保健功能。市场上售卖的醪糟若不完全杀菌会继续发酵甚至腐败变质，采用高温杀菌又会导致醪糟的部分营养成分破坏。

葡萄柚籽提取物（GSE）是一种商业化的植物提取物，是从葡萄柚（Citrus paradisi Macfaden） 种籽和果肉中提取出的，化学名称为复合联苯酚羟基苯，分子量为565。GSE中含有大量的多酚类物质，如儿茶酚、表儿茶酸以及二聚体、三聚体和四聚体原花青素。尽管GSE中主要的抗菌物质还不完全清楚，但是多酚类物质具有很强的抗氧化活性，特别是类黄酮，它们的含量与GSE被认为在抑菌方面发挥了很重要的作用［2］。GSE是一种非常有潜力的高效广谱抑菌化合物，在极低质量分数时就可取得明显的杀菌效果，它能抑制革兰氏阴性、革兰氏阳性细菌［3-4］和真菌［5］，抑制病毒与寄生虫［6］。美国农业部（USDA）1980年检测结果表明，GSE对动物没有毒性，并获得批准生产［7］。

我国常用的化学防腐剂有苯甲酸钠、山梨酸钠等，天然防腐剂主要有壳聚糖、茶多酚等，葡萄柚籽提取物作为防腐剂的研究并不多见。Park等人研究表明，葡萄柚籽提取物（GSE）可破坏微生物的细胞壁并可抑制微生物的生长，另外也有研究表明GSE还具有抗氧化特性，因此将其作为防腐剂用于食品加工，可防止被微生物感染，并有效地延长货架期。本研究拟通过添加不同质量浓度的葡萄柚籽提取物，探究其对传统醪糟的保藏过程、品质等多方面影响，以pH值、糖度、菌落总数、酵母菌、霉菌、感官评定等为评价指标，探讨传统醪糟保藏的有效方法，为进一步新型非化学天然防腐剂的开发提供理论依据。

1　主要原料与设备

1.1主要原料与试剂

圆江米、蒸馏水、革兰氏染液、石碳酸棉兰染液、复红染液、美蓝染液；甜酒曲发酵剂为安琪甜酒曲；葡萄柚籽提取物（GSE），购自杨凌天成试剂公司。

1.2主要培养基

营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、EC肉汤、EMB培养基、LB培养基等。

1.3主要仪器设备

超净工作台、电热恒温培养箱、电热套、水浴锅、高压蒸气灭菌锅、pH计、酒精计、手持糖度计、电子分析天平、温度计、蒸锅、发酵桶、超净工作台、光学显微镜等。

1.4醪糟酿造方法

圆江米浸泡5 h左右，泡好的圆江米再次清洗沥干水分后放入蒸锅蒸熟，蒸的过程中稍微翻拌，待蒸熟没有硬心时关火晾凉，或过1次凉水使其稍降温。将糯米饭翻面，使其温度降至30℃左右，这时撒入已擀成粉的甜酒曲拌匀，在桶里按压使其表面平整，在中间掏一个洞，在洞口壁以及表面再撒上少量甜酒曲，盖上盖子，使桶温保持在30～35℃，并恒温培养2～3 d。

2　试验方法

2.1样品处理及GSE对比添加

将制好的醪糟分装到6个500 mL玻璃罐头瓶中，经巴氏消毒后待用，将商品化的粉末状葡萄柚籽提取物（GSE）水浴加热溶解制成质量分数为10%的溶液，按照0，0.05%，0.10%，0.15%的质量浓度梯度添加入已分装处理好的醪糟样品中，振摇混合均匀。其余设置1个空白对照组和1个市售玻璃瓶装醪糟组，保证样品组间液体量相等。

2.2甜酒曲菌种分析

取适量醪糟的发酵剂甜酒曲加水加热溶解制成质量分数为10%的溶液，制备10倍系列稀释样品匀液，稀释度10-1～10-7，选择10-2～10-4稀释度的样品液，吸取1 mL接种于营养琼脂培养基和孟加拉红培养基，培养箱中倒置培养并观察菌落情况。培养结束后，取培养物制片在光学显微镜下观察其特征。

2.3发酵醪糟的微生物分离培养

2.3.1菌落总数测定

采用营养琼脂培养基，根据国家标准GB 47892—2010测定。样品组进行统一的预处理后进行10倍系列稀释，取10-2～10-4稀释度的样品液作为接种样，吸取1 mL样品液接种于营养琼脂培养基上并涂抹均匀，于36±1℃条件下倒置培养48±2 h，做2组重复，最后记录稀释倍数和相应的菌落数量并做计算。

2.3.2酵母菌、霉菌测定

采用孟加拉红培养基，根据国家标准GB 478915—2010测定。样品组进行统一的预处理后进行10倍系列稀释，取10-2～10-4稀释度的样品液作为接种样，吸取1 mL样品液接种于孟加拉红培养基上并涂抹均匀，于28±1℃条件下倒置培养5 d，做2组重复，最后记录稀释倍数和相应的菌落数量并做计算。

2.3.3大肠菌群测定

采用月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、EC肉汤、EMB培养基，根据国家标准GB 47893—2010测定。样品组进行统一的预处理后进行10倍系列稀释，取10-2～10-4稀释度的样品液作为接种样，每个稀释度取1 mL接种3管LST肉汤，于36±1℃条件下培养24±2 h，若有产气者进行复发酵试验，未产气则继续培养48±2 h，复发酵试验中产气者进行EMB平板分离培养和营养琼脂培养，最后取培养物进行革兰氏染色和生化试验，报告大肠埃希氏菌MPN结果。

2.3.4菌群初步鉴定

（1）霉菌培养物直接镜检。在长有霉菌的平板上挑取少量菌丝，采用水浸片法（石碳酸棉兰）制片并置于低倍显微镜下，分别观察它们的孢子囊梗的形状排列、着生位置、分支情况及孢子囊的形状，并注意有无假根等特征。

（2）酵母菌培养物直接镜检。将长有酵母菌的平板挑取少量菌丝用水浸法（美蓝染液）制片，并置于低倍显微镜下观察酵母菌细胞形状、有无出芽、芽体形状大小。

（3）乳酸菌培养物制片镜检。将长有疑似乳酸菌的平板挑取少量细菌按照细菌的革兰氏染色法制片，并置于高倍显微镜下用油镜观察。

2.4醪糟的理化指标测定

2.4.1pH值测定

取保藏期的醪糟原液适量，用精密pH计测定pH值，测定3次取平均值，测定频率1次/d，绘制变化曲线图［8］。

2.4.2糖度测定

取保藏期的醪糟原液适量，用手持糖度仪测定糖度，测定3次取平均值，测定频率1次/d，绘制变化曲线图。

2.4.3酒精度测定

取保藏期的醪糟原液500 mL，经纱布过滤得清液100 mL，加入200 mL蒸馏水进行蒸馏，得蒸馏液约100 mL，插入酒精比重计并根据酒精度换算表测定室温下的酒精度，于保藏起点和终点进行测定。

2.5醪糟的感官评定

取50 g样品于洁净的白瓷盘中，目测其色泽、组织状态和外来杂质，用鼻嗅其气味，并尝其滋味，与以下标准进行比较，作出评价。

感官评价标准见表1。

表1　感官评价标准

3　结果与分析

3.1甜酒曲菌种分析结果

取10-3稀释度培养液1 mL在培养基中培养，观察孟加拉红培养基中菌株生长状况，并取待鉴定菌株在光学显微镜下观察［9-10］。

根霉平板生长情况见图1，酵母菌平板生长情况见图2，酵母菌见图3，根霉见图4，孟加拉红培养基上霉菌生长情况见表2，孟加拉红培养基上酵母菌生长情况见表3，镜检结果见表4，。

图1　根霉平板生长情况

经光学显微镜观察和相关文献查询，甜酒曲发酵剂中主要有米根霉（Rhizopus oryzae）和酿酒酵母（Saccharomyzes cerevisiae） 2种菌种［10］，其中霉菌属于较高等的微生物，主要依靠形态学特征进行鉴定。本试验主要集中在对酵母菌的形态鉴定，并根据相关文献进行鉴定。

图2　酵母菌平板生长情况

图3　酵母菌

图4　根霉

表2　孟加拉红培养基上霉菌生长情况

表3　孟加拉红培养基上酵母菌生长情况

表4　镜检结果

3.2醪糟的微生物培养及微生物学检验

3.2.1优势菌株的确定

添加GSE后酵母菌镜检见图5，不同质量分数GSE处理组菌落生长情况见图6。

图5　添加GSE后酵母菌镜检

图6　不同质量浓度GSE处理组菌落生长情况

醪糟样品经添加GSE后在其保藏过程中无霉菌和其他杂菌生长，仅有酵母菌生长。醪糟培养过程中，酵母菌是主要的酒化发酵剂，在发酵中期，伴随霉菌分解淀粉产生大量的糖，酵母菌的数量开始增多，到后期则占绝对优势，使醪糟酒精度适量增高抑制了其他细菌的生长繁殖；同时随保藏过程的延长，酵母菌菌落数逐渐降低，避免了过度产生酒精影响饮品口感风味，对醪糟的保藏过程产品性质的稳定起到一定作用。初步判定GSE有抑制杂菌，使酵母菌在一定时间段内产生菌种优势的特点。

3.2.2菌落数量变化

（1）不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间细菌菌落总数的影响。

GSE对醪糟保藏期菌落总数的影响见图7。

图7　GSE对醪糟保藏期菌落总数的影响

由图7可知，随着贮藏时间的延长，菌落总数呈先上升后下降的趋势，且同一时间测定的菌落总数基本随着GSE质量分数增加而减少。保藏后期对照组菌落总数呈上升趋势，GSE处理组都呈下降趋势，但变化不明显，添加GSE对菌落总数无明显效果。

（2）不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间酵母菌、霉菌的影响。

GSE对醪糟保藏期真菌数的影响见图8。

图8　GSE对醪糟保藏期真菌数的影响

经镜检已知GSE处理组中保藏期平板上所有菌均为酵母菌，所以图8也可看作是酵母菌数量变化图。由图8可知，随着贮藏时间的延长，GSE处理组中酵母菌数量明显增多，且随着GSE质量分数增加而增加，到保藏后期则占绝对优势，使醪糟酒精度适量增高，抑制了微生物的生长繁殖；同时随保藏过程的延长，酵母菌落数逐渐降低，避免了过度产生酒精影响饮品口感风味。整体上讲，GSE有一定的保鲜效果。

3.3不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间理化性质的影响

（1）不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间酸度的影响。

根据DB 31433—2009酒酿卫生要求，原汁酒酿醪糟的总酸（以乳酸计）要求≤10.0 g/kg。

GSE对醪糟贮藏期间影响pH值变化见图9。

图9　GSE对醪糟贮藏期间影响pH值变化

由图9可知，随着贮藏时间的延长，对照组的pH值初期短时间内变化不稳定，后期呈现逐渐降低的趋势，且在保藏第15天降至较低水平；而GSE处理组初期pH值下降较快，原因可能由于GSE本身呈酸性，保藏过程一开始加入样品中，导致其pH值迅速降低，后期呈现下降的趋势，但保藏后期pH值的下降速度明显低于对照组，pH值下降缓慢则减缓了醪糟口感风味的降低速度，更有利于鲜食。这说明GSE的保鲜效果较好，且质量分数为0.10%处理的样品保鲜效果最好［11］。

（2）不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间糖度的影响。

根据DB 31433—2009酒酿卫生要求，原汁酒酿（醪糟）的还原糖（以葡萄糖计）要求≥15.0 g/100 g。

GSE对醪糟贮藏期间影响糖度变化见图10。

图10　GSE对醪糟贮藏期间影响糖度变化

由图10可知，随着贮藏时间的延长，对照组的糖度初期短时间内变化不稳定，后期呈现逐渐降低趋势且保藏12 d后下降速度较快；而GSE处理组初期变化不稳定，可能由于GSE加入后影响霉菌等微生物的正常代谢，使微生物的代谢一定程度上紊乱，后期再保藏5 d糖度下降的速度明显变缓，且在15 d的保藏期内低于对照组，对醪糟口感风味的保持有一定作用。其中，质量浓度为0.05%和0.10%的GSE保鲜效果较好。

3.4不同质量分数GSE处理对醪糟保藏期间整体感官品质的影响

根据DB 31433—2009酒酿卫生要求，原汁酒酿（醪糟）的感官要求如下。

感官评定标准见表5，感官评定结果见表6。

表5　感官评定标准

不同质量浓度GSE对醪糟保藏期整体感官品质的影响如表6所示，各项指标最低分为10分，即感官评分总分低于40分则样品已丧失食用价值。根据表5所示，基本感官要求醪糟样品需保持米粒呈白色、乳白色或微黄色，酒液呈乳白色或淡黄色；有酒酿固有的气味，酒香味浓郁；有酒酿固有的滋味，味浓甜，略带酸味，爽口，不得有苦涩、酸败味。对照组在保藏过程中气味和滋味等逐渐降低，保存至15 d时评分低于40分已不能食用。GSE处理组色泽评分较低，由于GSE为黄色粉末，加入样品后样品整体呈微黄色，且添加质量分数越高、黄色越深，同时处理组的气味评分也较低，米酒特有香气较快散失，但滋味部分比对照组的评分普遍高，口感保持度较好，也印证了酸度和糖度的变化。从整体看，在保藏期15 d内，整体感官评分GSE处理组的评分高于对照组，其中质量分数为0.05%和0.10%的GSE保鲜效果较好［12］。

表6　感官评定结果

4　结论

霉菌是醪糟生产的主要糖化发酵剂。霉菌不形成孢子囊孢子，依靠大量的菌丝进行增殖，生长过程中产生大量的蛋白酶、糖化酶、液化酶以及酒化酶，生成大量的营养成分和形成醪糟独特的风味。醪糟培养过程中，酵母菌是主要的酒化发酵剂。从醪糟成品中分离出来的主要是酵母菌，经过鉴定为酿酒酵母。在发酵中期，伴随霉菌分解淀粉产生大量酵母菌，到后期则占绝对优势［13］。

本试验通过对醪糟样品的菌落总数、真菌数、pH值、糖度以及感官评定的测定，可以得出试验组比对照组的样品在保藏期内整体品质较好，且有明显的发酵菌种优势，GSE起到一定的防腐保鲜作用。通过0.05%GSE，0.10%GSE和0.15%GSE处理的样品保鲜效果相比较得出，经0.10%GSE处理的样品保藏后期pH值和糖度最高，且感官评定总分最高，综合分析得出GSE对醪糟保藏期有较好的影响。

［1］刘婧竟，乔发东.国内外甜酒曲研究进展 ［J］.中国酿造，2010（9）：21-25.

［2］张南，曹思硕，黄昆仑，等.葡萄柚种籽提取物对酿酒酵母抑制机理的研究 ［J］.食品科学，2010，31（5）：137-140.

［3］Reagor L J，Gusman L，Mc Coy E，et al.The effectiveness of treated grapefruit-seed extract as an antibacterial agent：An in vitro agar assay［J］.J.Altern.Complement. Med，2002（8）：325-332.

［4］Heggers J P，Cottingham J，Gusman L，et al.The effectiveness of processed grapefruit-seed extract as an antibacterial agentⅡ：Mechanism of action and in vitro toxicity［J］.J. Altern.Complement.Med，2002（8）：333-340.

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［7］许文涛，田慧琴，罗云波，等.葡萄柚提取物对红地球葡萄保鲜效果的影响 ［J］.保鲜与加工，2007，7（2）：14-16.

［8］刘婧竟，乔发东.甜酒曲生长特性研究及米酒生产工艺优化 ［J］.中国酿造，2010（12）：41-45.

［9］李永波，岳文，邓功成，等.甜酒曲中主要的微生物菌群分离及发酵优化 ［J］.黔南民族师范学院学报，2013，33（6）：102-105.

［10］朱海泉，鲁海波，王龙祥.甜酒曲的开发与研究进展 ［J］.山东食品发酵，2012（2）：49-52.

［11］许文涛，黄昆仑，屈玮，等.葡萄柚种籽提取物对真菌的抑制作用及其在葡萄和柿子保鲜中的应用 ［J］.食品科学，2008，29（10）：41-46.

［12］金海莉，王海丽，梁成云，等.葡萄柚籽提取物对延边黄牛肉保鲜效果的影响 ［J］.肉类研究，2013（6）：29-32.

［13］许磊，罗成，刘华戎，等.醪糟发酵微生物的分离鉴定 ［J］.食品与发酵科技，2012，48（2）：65-70.◇

Effect of Grapefruit Seed Extract on Preserving Quality and Microbial Flora of Rice Wine

YAO Yuchen，LV Xin，ZHOU Yuan，LIANG Mingwei，WANG Zhenmeng，DU Ruoxi，YE Meng，*LIU Bianfang
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling，Shannxi 712100，China）

The rice wine is a kind of rich nutrition and unique flavor food.Grapefruit seed extract（GSE）is a broad spectrum antibiotics for bacteria，fungi and fungicide and it should have very good effect on food preservation.Study on the effect of grapefruit seed extract on preserving quality and microbial flora of rice wine.After adding different concentrations of GSE in the low temperature preservation rice wine，test its flora change including yeast，mold and other microorganism.Test the sugar concentration，alcohol concentration and other physical and chemical index.Use sensory evaluation method to assess the rice wine with grapefruit seed extract.Reveal the function of GSE on preservation of rice wine and provide theoretical basis for the further development of novel food preservatives.

rice wine；grapefruit seed extract；microorganism；preservation

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.038

1671-9646（2016）07b-0030-05

2016-06-04

中国博士后基金项目（K308021301）；大学生科技创新项目（2014107）。

姚宇晨（1995— ），女，在读本科，研究方向为食品质量与安全。

刘变芳（1975— ），女，博士，副教授，研究方向为食品微生物。