HPLC法测定赣南脐橙中维生素B1、维生素B2含量

唐丽君，胡国英，涂正波，张　硕

(1江西省食品检验检测研究院，南昌　330006；2南昌市疾病预防控制中心，南昌　330038； 3江西省产品质量监督检测院，南昌　330006)



HPLC法测定赣南脐橙中维生素B1、维生素B2含量

唐丽君1，胡国英1，涂正波2，张硕3

(1江西省食品检验检测研究院，南昌330006；2南昌市疾病预防控制中心，南昌330038；3江西省产品质量监督检测院，南昌330006)

目的：建立2种不同的HPLC法测定赣南脐橙中维生素B1及维生素B2含量，通过比较，得出适合赣南脐橙维生素B1及维生素B2含量测定的最佳方法。方法：色谱条件：色谱柱：C18反相色谱柱(粒径5μm，150 mm×4.6 mm)；流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液-甲醇=65∶35(pH值4.6)；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长：维生素B1激发波长375nm、发射波长435nm；维生素B2激发波长462nm、发射波长522nm。结果：维生素B1和维生素B2线形范围是0.01～1.00μg/mL，最低检出限为0.001μg/mL；果皮、果肉维生素B1平均回收率分别为95.3%、92.98%；果皮、果肉维生素B2平均回收率分别为89.1% 、84.6% 。结论：此方法简单、准确，可用于测定赣南脐橙中的维生素B1及维生素B2含量。

HPLC；荧光检测器；赣南脐橙；维生素B1；维生素B2

赣南脐橙果大形正、橙红鲜艳、光洁美观，可食率达85%，肉质脆嫩、化渣、风味浓甜芳香，含果汁55%以上。目前较多报告集中在对赣南脐橙维生素C含量的研究，较少有对赣南脐橙中维生素B1及维生素B2含量的研究。B族维生素是水溶性维生素中重要的一类，其中多种是酶的辅基和酶的组成部分。目前对于食品中水溶性维生素的分析方法较多，如分光光度法、荧光法、微生物法等[1-3]，这些方法常常由于样品基质复杂，干扰物质较多而使测定结果不准，给定量分析带来一定的困难。本文采用液相色谱法测定赣南脐橙中果肉及果皮中维生素B1及维生素B2的含量。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

新鲜赣南脐橙(选用信丰安西脐橙)、维生素B1、维生素B2(纯度99%)，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈、正丁醇(色谱纯)，美国Honeywell公司；Milli-Q水纯化系统，美国Millipore公司；三水乙酸钠、铁氰化钾、氢氧化钠、冰乙酸、浓盐酸、偏磷酸，均为分析纯。

1.2仪器

安捷伦液相色谱仪1200(带紫外及荧光检测器) ，美国Angilent公司；冷冻离心机，美国Sigma公司；均质机，德国IKA公司；移液枪，美国ThermoElectron公司；50 mL聚乙烯管、容量瓶。

1.3方法

1.3.1标准溶液配制[4，5]

维生素标准储备液(500μg/mL)：各称取相当于50 mg(精确至0.1mg)的维生素B1及维生素B2标准品，用0.01mol/L盐酸(4.13)溶解并定容于100mL。置于0～4 ℃冰箱中，保存期为3个月。

维生素B1及维生素B2标准中间液及标准工作液：准确吸取2.00mL标准储备液，用水稀释并定容至100mL，此溶液中维生素B1及维生素B2浓度为10μg/mL。吸取维生素B1维生素及B2标准中间液配制成标准系列浓度分别为0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL的标准工作液。临用前配制。

1.3.2溶液配制

氢氧化钠溶液(100g/L)：称取25g氢氧化钠，用水溶解并定容至250mL；铁氰化钾溶液(20g/L)：称取2g铁氰化钾，用水溶解并定容至100mL，临用前配制；碱性铁氰化钾溶液：将5mL铁氰化钾溶液与200mL氢氧化钠溶液混合，临用前配制。

1.3.3液相色谱条件

方法一(荧光检测器)条件：色谱柱：资生堂C18反相色谱柱(粒径5μm，150mm ×4.6 mm)或相当者；流动相：0.05 mol/L 乙酸钠溶液-甲醇= 65+35 (pH 4.6)；流速1.0mL/min；进样量20μL；柱温30 ℃；检测波长：维生素B1激发波长375nm、发射波长435nm；维生素B2激发波长462nm、发射波长522nm。

方法二(紫外检测器串联荧光检测器)条件：色谱柱：资生堂 C18反相色谱柱(粒径 5μm，150mm ×4.6 mm)或相当者；0.05 mol/L乙酸钠溶液-甲醇= 70+30 (pH4.6)；流速1.0mL/min；进样量20μL；柱温30 ℃；检测波长：维生素B1：251nm；维生素B2：激发波长 462 nm，发射波长 522 nm。

1.3.4前处理方法

方法一：称取已混匀样品10～20g于50mL离心管，用10 g/L偏磷酸溶液[6]调节溶液pH值4～5之间，充分摇匀加水定容至刻度，在8 000r/min条件下离心5 min，取上清液过0.45μm膜上机测定维生素B2。另取滤液10mL，按国标GB5413.11-2010方法处理维生素B1。

方法二：称取已混匀样品10～20g于50mL离心管，用10 g/L偏磷酸溶液调节溶液pH值4～5之间，充分摇匀加水定容至刻度，在8 000r/min条件下离心5 min，取上清液过0.45μm膜上机测定维生素B1及维生素B2。

2　结果与分析

2.1系统适应性考察[7]

考察两种方法的系统适应性，见图1及图2。

图1　维生素B1及维生素B2标样色谱图

图2　维生素B1及维生素B2混合标样色谱图

由图1可见，方法一中维生素B1和维生素B2保留时间分别在2.597、3.995min，且峰型正常，无拖尾现象，分离效果良好。由图2可见，方法二中维生素B1和维生素B2保留时间分别在5.487、10.103min，峰型正常，说明分离效果良好，维生素B1是在紫外251nm下测定，为了在同一条件下得到良好的图谱峰形，维生素B1标准溶液的浓度是维生素B2的10倍。

2.2线性关系考察

方法一：将逐级稀释的标准工作液分别进样20μL，测定结果经线性回归，线性范围：维生素B1及维生素B2为0.01～1.00 μg/mL，各物质标准曲线方程、相关系数、检出限以及定量限见表1。

表1　方法一维生素B1及维生素B2的回归方程、相关系数和线性范围

方法二：维生素B1将逐级稀释的标准储备液分别进样20μL，测定结果经线性回归，线性范围：维生素B1为0.50～50μg/mL、维生素B2为0.01～1.00 μg/mL，各物质标准曲线方程、相关系数、检出限以及定量限见表2。由表1及表2可见，方法一及方法二均有较好的线性关系。方法一较方法二维生素B1检出限更低，适合测定维生素B1含量较低的物质。

表2　方法二维生素B1及维生素B2的回归方程、相关系数和线性范围

2.3精密度试验

方法一：分别精密吸取浓度为0.20μg/mL维生素B1和维生素B2标准工作液20μL，连续进样5次，测定峰面积，计算各水溶性维生素RSD见表3。

表3　方法一精密度试验结果

方法二：精密吸取维生素B1(2.0μg/mL)维生素B2(0.2μg/mL)标准工作液20μL，连续进样5次，测定峰面积，计算各水溶性维生素RSD见表4。

表4　方法二精密度试验结果

由表3可见，方法一的精密度试验结果相对标准偏差RSD变化为1.22%～3.43%，平均RSD为2.33%，满足试验要求，其中维生素B1精密度试验结果的相对标准偏差小于维生素B2精密度试验结果。由表4可见，方法二的精密度试验结果相对标准偏差RSD变化为3.75%～4.24%，平均RSD为4.00%，满足实验要求，其中维生素B2精密度试验结果的相对标准偏差小于维生素B1精密度试验结果。2种方法的精密度均良好。

2.4稳定性试验

方法一：将维生素B1和维生素B2标准工作液(0.20μg/mL)放置室温条件下，并且不做避光保护，精密吸取各标准样品溶液20μL，在0、2、4、8h分别进样。分别记录峰面积，考察维生素B1和维生素B2的稳定性，结果见表5。方法二：将维生素B1(2.0μg/mL)和维生素B1(0.20μg/mL)标准工作液放置室温条件下，并且不做避光保护，精密吸取各标准样品溶液20μL，在0、2、4、8h分别进样。分别记录峰面积，考察维生素B2和维生素B1的稳定性，结果见表6。

表5　方法一稳定性试验结果

表6　方法二稳定性试验结果

由表5及表6可见，在室温、不做避光保护条件下，方法一中维生素B1较方法二中维生素B1稳定性好，2种方法维生素B2稳定性相差不大。

2.5重复性试验

方法一：将样品果皮及果肉取50g，平均分为5份，并按方法一进行样品处理，各取20μL进行重复性试验，用外标法分别计算出样品的质量浓度，结果见表7。方法二：将样品果皮及果肉取50g，平均分为5份，并按方法二进行样品处理，各取20μL 进行重复性试验，用外标法分别计算出样品的质量浓度，结果见表8。

表7　方法一重复性试验结果

由表7可见，样品果皮及果肉中均含有维生素B1和维生素B2，方法一重复性试验中结果标准偏差RSD变化为1.40%～2.77%，满足试验要求。由表8可见，样品采用方法二检测样品中维生素B1含量低于仪器检出限，所以果肉及果皮均未检出维生素B1的含量。选定方法一作为赣南脐橙维生素B1及维生素B2的检测方法，对样品进行加标回收及含量分析。

表8　方法二重复性试验结果

2.6加标回收率试验

由于方法二对基质较复杂及含量较低的维生素B1定量准确度不高，因此仅对方法一进行样品加标回收实验。取样品果肉及果皮并按方法一进行样品处理，在线性范围内，采用加标回收的方法对准确度进行验证。同一样品中分别加入高、中、低3种混合标准溶液，每个加标浓度平行测定6次，与样品同时前处理和测定，回收率在82.1%～101.2%之间(表9)。

表9　回收率试验结果

2.7样品各维生素含量

采用方法一测定：分别称取已均匀制样的果肉及果皮5个样品进行测定，平行测定3次，根据样品色谱图与标准溶液色谱图比较和分析，保留时间进行定性分析，判断样品中所含水溶性维生素种类。通过外标法计算得到样品中相应维生素的含量，由表10可知，维生素B1含量果肉略高于果皮、维生素B2含量果皮是果肉的3倍。

表10　样品中维生素含量测定结果

(续)

3　讨论

3.1检测波长的选择

方法一是依据国标方法采用荧光法测定，维生素B1(Ex：375 nm、Em：435 nm)维生素B2( Ex：462 nm、Em：522 nm)；方法二中标准品溶液分别在210～800nm 波长范围内扫描，发现维生素B1在251.3 nm处有最大吸收，这与华永有等[8]报导紫外扫描维生素B1在 246.8 nm 处有最大吸收相近，故本试验方法二维生素B1采用251 nm、维生素B2用荧光(Ex：462 nm、Em：522 nm)检测。

3.2分离条件的选择

(1)探索了三氟乙酸/乙腈[9]、甲醇/三乙胺的磷酸二氢钾溶液[10]、辛烷磺酸钠/甲醇[11]、己烷磺酸钠/甲醇[7]、乙酸钠/甲醇[1，12]体系流动相，结果表明，方法一选用0.05 mol/L乙酸钠溶液—甲醇=65：35，能达到良好的分离效果，且由于增加了流动相中的甲醇的比例节约了色谱分离时间；方法二选用0.05 mol/L乙酸钠溶液—甲醇=70：30，可有效缓解拖尾峰对分离的影响，且由于降低了流动相中的甲醇的比例，维生素B1和维生素B2的出峰时间推后，减少了紫外吸收下溶剂峰的干扰，提高了维生素B1定量分析的准确性。(2)探讨了在相同的流动相组成、流速以及洗脱程序条件下，改变柱温箱温度：当柱温在5～35℃时，色谱峰的分离度和峰形无明显差异，色谱峰保留时间有微小变化。综合考虑选取柱温30℃为最佳试验条件。(3)探讨了在相同的流动相组成、流速以及洗脱程序条件下，改变流动相pH值：采用pH值分别为3.00、3.75、4.00、4.20、4.60、4.80的醋酸钠溶液作为流动相进行梯度洗脱，考察流动相pH值分离的影响。pH<4.20时，方法一中维生素B1及维生素B2出峰时间分别提前，不影响分离效果；方法二中维生素B1及维生素B2保留时间比较集中，分离效果不佳。结果表明，分离效果pH值4.6时，试验条件最佳。

3.32种方法分析比较

方法一在样品前处理中增加了维生素B1衍生过程，其方法灵敏度较高，且色谱峰图谱基本无杂峰，有利于样品的定性定量分析，适用于基质较复杂、且维生素B1含量较低的物质；方法二的样品前处理较方法一简单，也具有良好的线性范围，精密度及稳定性，但由于维生素B1的检测波长为251nm，在此波长下大多数物质具有紫外吸收，影响样品中维生素B1的定性定量分析，适合于基质简单，且维生素B1在样品中含量较高的样品，特别是一些维生素功能饮料及维生素片。

3.4样品各维生素组分中的实际含量

脐橙中果皮与果肉中维生素B1相差不大，果皮中维生素B2含量是维生素B1含量的3倍多，对于开发利用脐橙果皮、果肉产品提供了可靠的参考数据。

4　结论

通过比较，选取方法一作为赣南脐橙中维生素B1及维生素B2含量测定的方法，结果表明，果肉中维生素B1含量平均值13.0μg/100g、果皮中维生素B1含量平均10.9μg/100g；果肉中维生素B2含量平均值18.6μg/100g、果皮中维生素B2含量平均值57.3μg/100g。该法灵敏度高，样品分离效果佳，明显提高了检测准确性和重复性。◇

[1]Arya SP，Mahajan M，Jain P.Improved Detection of Ascorbic Acid with a Bismuth-Silver Nanosensor[J].Rev Anal Chim Acta，2000，417：1-14.

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[3]Ancos B，Gonz alez EV，Cano MP.J Agric Food Chem，2000，48：4565-4570.

[4]GB5413.11-2010 婴幼儿食品和乳品中维生素B1的测定[S].

[5]GB5413.12-2010 婴幼儿食品和乳品中维生素B2的测定[S].

[6]GB5413.26-2010 婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定[S].

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[9]蒲明清，等.超高效液相色谱法测定保健食品中的多种水溶性维生素[J].现代食品科技，2012，28(7)：886-889.

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(责任编辑李燕妮)

Determination on Vitamin B1and Vitamin B2in Gannan Navel Orange by HPLC

TANG Li-jun1，HU Guo-ying1，TU Zheng-bo2，ZHANG Shuo3

(1Jiangxi Institute for Food Control，Nanchang 330006，China；2Nanchang Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330038，China；3Jiangxi Institute of Supervision & Inspection on Product Quliaty，Nanchang 330006，China)

ObjectiveTo develop two kinds of HPLC methods for determination on vitamins B1and vitamins B2in Gannan navel orange.By comparing the two methods，results showed that it was suitable for Gannan navel orange detection method of vitamin B1and vitamin B2content.MethodC18column(5μm，150 mm× 4.60 mm)was used as stationary phase.The mobile phase was composed of 0.05 mol/L Sodium acetate solution and methanol (70：30) at pH 4.6.The flow rate was 1.0 mL/min with the column temperatureat 30℃.Excitation wavelength of vitamin B1was 375 nm，emission wavelength was 435 nm，excitation wavelength of vitamin B2was 462 nm，the emission wavelength was 522 nm.ResultThe standard curves developed exhibited a good linear over a range of 0.01～1.00μg/mL for VB1and VB2.The detection limits for VB1and VB2were 0.001μg/mL.The average recoveries of the peel and the pulp were 95.3% and 92.98% for VB1，respectively.The average recoveries of the peel and the pulp were 89.1% and 84.6% for VB2，respectively.ConclusionThis method was simple and accurate.and could be used in the determination on vitamins B1and vitamins B2in Gannan navel orange.

HPLC；fluorescence detector；Gannan navel orange；vitamin B1；vitamin B2

唐丽君(1981—)，女，硕士，工程师，研究方向：食品安全检验。