氯化甲基汞对发育阶段大鼠小脑 PKCδ mRNA及蛋白表达的影响①

张宏宇　刘忠山　王铁君　李志超　郭　杰

(吉林大学第二医院放疗科,长春130041)



氯化甲基汞对发育阶段大鼠小脑 PKCδ mRNA及蛋白表达的影响①

张宏宇②刘忠山王铁君李志超③郭杰

(吉林大学第二医院放疗科,长春130041)

①本文为吉林省卫生厅科研基金资助项目(3D5097923427)、吉林大学基本科研业务费专项基金资助项目(421030140427)、吉林大学青年教师基金资助项目(419070210048)。

②中国人民解放军208医院461临床部,长春130061。

③吉林大学公共卫生学院，长春130061。

目的：观察氯化甲基汞对发育大鼠小脑中 PKCδ mRNA 及蛋白表达的影响。方法：建立发育大鼠小脑甲基汞损伤实验模型。采用核酸原位杂交方法(In Situ Hybridization, ISH )检测 δ 型蛋白激酶 C(PCKδ) mRNA 表达。采用Western blot方法检测PKCδ蛋白表达。结果：实验组和对照组仔鼠在出后就即可检测到小脑蒲肯野细胞 PKCδ表达，且随生后时间延长表达水平虽有增高但幅度很小。各实验组仔鼠脑汞含量明显高于对照组，且实验组小脑蒲肯野神经元PKCδmRNA表达阳性率及小脑组织胞浆和胞膜PKCδ蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论：氯化甲基汞以剂量依赖方式和时间依赖方式促进仔鼠小脑蒲肯野细胞 PKCδmRNA及蛋白表达。 PKCδ亚类可能是甲基汞介导神经毒作用的关键靶分子。

氯化甲基汞;脑发育;PKCδ expression

氯化甲基汞(Methylmercury chloride,MMC) ，是一种亲脂性有机汞的环境污染物,极易透过血脑屏障，具有强烈的神经毒性作用[1-3]。既往的研究结果发现甲基汞可导致幼鼠脑神经细胞凋亡，引起发育阶段大鼠海马组织胞浆及胞膜蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)活性升高，并且以剂量依赖方式和时间依赖方式促进仔鼠小脑蒲肯野细PKCαmRNA表达[4-6]。另外，我们还观察到氯化甲基汞可以诱导脑胶质瘤细胞凋亡[7]。基于前述研究的结果，我们认为PKC可能是氯化甲基汞神经毒作用机制中的关键靶标。PKCδ是钙离子依赖型蛋白激酶, 是细胞增殖分化及凋亡信号通路中的关键分子，但其对中枢神经系统发育、分化的影响尚不清楚[8,9]。 因此本研究在建立甲基汞致大鼠小脑发育损伤模型的基础上,采用核酸原位杂交及Western blot方法观察氯化甲基汞对发育大鼠小脑 PCKδ 在mRNA和蛋白质水平上表达的影响，旨在深入研究甲基汞神经毒作用的分子机制。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器FV500 激光共聚焦显微镜 Olympus,日本； MMC 德国 Merck 公司。ISH检测试剂盒,武汉博士德生物公司。

1.2方法

1.2.1慢性氯化甲基汞暴露小脑发育损伤动物模型的建立，详见引文[4]。

1.2.2脑汞含量测定采用干烧法测定，详见引文[4]。

1.2.3ISH石蜡切片二甲苯脱蜡,乙醇梯度复水,预杂交,杂交,显色,相同区域显微镜下在同一放大倍数下计数，计10 个不同视野的阳性细胞数和细胞总数,计算阳性率。

1.2.4免疫印迹法(Western blot )脑组织样品制备:分离细胞浆PKC取鼠脑称重，加入匀浆缓冲液(50 mmol/L Tris-HCL pH7.5,0.32 mmol/L sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)。超声粉碎20 s共3次，每次间隔20 s。100 000 r/min 4℃，离心1 h。将上清，沉淀分开待用。

分离细胞膜PKC：用匀浆缓冲液含(1%Triton-X100，50 mmol/L Tris-HCl pH7.5,0.32 mmol/L Sucrose,0.25 μg/ml Leupeptin,0.1 μg/ml Aprotinin,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L PMSF)将沉淀悬起，100 000 r/min 4℃，离心1 h，留取上清。

蛋白质浓度测定：采用Bradford(1976)法[10]。

样品制备及SDS-PAGE电泳提取的样品蛋白定量后，置于1×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸3min使蛋白变性，每道上样量为50 μg/20 μl。接通电源，凝胶上所加电压8 V/cm。颜料前进至分离胶后，电压提高至15 V/cm,继续电泳至溴酚兰达到分离胶底部。

蛋白质的电转移：电泳后切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的滤纸和1张硝酸纤维素膜，将它们浸泡于转移缓冲液中，在塑料支架上依次叠放浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，各层之间精确对齐且无气泡存在，将支架夹扣扣紧后，置于电转移槽中，硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加入转移缓冲液和冰盒，30 V电压过夜转移。

封闭：电转移结束后，将封闭液均匀加至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h，以封闭无关蛋白质结合位点。转移后凝胶用考马斯亮兰染色，检查蛋白是否转移完全。

抗体的结合：封闭后的硝酸纤维素膜用PBST漂洗3次，每次5 min。以抗体稀释液稀释一抗。取一保鲜膜，四角固定于大平皿上，滴加一抗溶液，将硝纤膜覆盖在该溶液上(注意：转移面与抗体溶液接触)，37℃反应2 h。洗涤后的膜按同样方法与二抗溶液反应2 h。暗室中显影目标蛋白带，采用ImageQuantTMTL分析条带灰度。

2　结果

2.1MMC母鼠喂养对仔鼠小脑汞含量的影响MMC 染毒的实验组仔鼠小脑汞含量均明显高于对照组(P<0.001),并且随母鼠接触 MMC 剂量的增多而增高(P<0.001) 。 三种浓度的实验组仔鼠小脑汞含量在出生后均随时间的延长而有不同程度升高,且均明显高于相应对照组(P<0.001) 。

2.2氯化甲基汞对仔鼠小脑 PKCδ mRNA 表达的影响大鼠初出生PKCδ mRNA即可广泛高水平表达于新生鼠小脑皮质蒲肯野神经元。同时我们发现新生大鼠小脑颗粒及分子层细胞PKCδ mRNA表达量极低。随生后时间的延长，PKCδ表达水平虽有增高但幅度很小，这与我们以往观察PKCα mRNA表达随生后时间延长而递增的表达模式不同[6]。我们提取实验组生后不同时间仔鼠小脑组织测定汞含量计数PKCδ mRNA阳性表达细胞，发现随脑汞含量增加实验组仔鼠小脑蒲肯野细胞PKCδmRNA表达阳性率明显升高(P<0.05)，并且这种表达变化呈现剂量-效应模式。与对照组相比，PKCδmRNA阳性表达细胞在3个剂量水平氯化甲基汞摄入组分别增加了8.8%，16.9%，24.6%。见图1。

2.3氯化甲基汞对仔鼠小脑 PKCδ 蛋白表达的影响采用Western blot法在蛋白质水平检测PKCδ脑表达，研究观察到与ISH方法检测一致的结果，即PKCδ蛋白在仔鼠初出生后就广泛高表达于小脑组织胞浆和胞膜,在生后30 d达峰值。且实验组仔鼠小脑组织胞浆和胞膜PKCδ蛋白表达水平均明显高于对照组(见表1及图2)。

图1　MMC慢性暴露对PKCδ mRNA 表达的影响Fig.1　Time-courses change pattern of PKCδ mRNA expression in postnatal rat cerebellumNote: *.P<0.001.

表1　Western blot法检测不同浓度氯化钾基汞对仔鼠脑神经元胞膜及胞浆PKCδ蛋白表达条带灰度值的影响Tab.1　Expression of PKCδ in cytosol and membrane of PND30 rat cerebellum from control and different concentrations of MMC exposure groups by Western blot analysis

图2　Western blot法检测仔鼠小脑神经元胞膜及胞浆PKCδ蛋白表达Fig.2　Representative immunoblots showing protein expression of PKCδ in rat cerebellum from Western blot analysisNote: All postnatal cerebellum samples were from rats of a single litter.The molecular weights for PKCδ subunit is 76 kD.

3　讨论

PKC在机体对外界刺激产生反应的信号通路中起重要作用，是信号通路的中心分子，参与细胞增殖、分化、凋亡及癌变，与细胞信息传递、细胞分泌、细胞膜离子通道调节等重要生理过程。PKCδ 作为PKC家族中的关键分子，发挥着重要的生理学功能，它是一类钙离子依赖性的 PKC 亚类蛋白,处于增殖分化期的神经细胞中检测到PKCδ高表达，PKCδ低表达于成熟的神经组织, PKCδ的功能与神经元细胞的死亡和/或凋亡密切相关[11]。本研究中我们在mRNA和蛋白质水平上观察到PKCδ在仔鼠出生即出现高表达。这一结果与既往我们研究中观察到的PKCα的表达不同[6]。提示PKC不同亚类之间表达模式不同，在神经系统发育过程中的作用不同。在本研究MMC 致小脑发育损伤大鼠模型中,观察到随着脑汞含量的增加PKCδ mRNA 和蛋白质表达上调,且这种变化呈剂量依赖性关系。提示 PKCδ 可能是MMC 致脑发育损伤的关键靶分子。根据以往MMC理化特性及神经细胞发育信号通路的研究成果，我们分析其可能的机制与以下因素有关[12-15]：(1)PKCδ 激活后,上调 Fos 蛋白表达,促进蛋白酶、核酸内切酶的合成和活化,加速细胞凋亡;(2)作用细胞色素 C 释放,诱导神经细胞凋亡及损伤；(3)促进TNF-δ 释放增加,趋化炎细胞局部浸润, 加重脑组织损伤和细胞坏死凋亡。另外，我们既往的研究还观察到氯化甲基汞可以诱导脑胶质瘤细胞凋亡，提示甲基汞可能具有潜在的抗肿瘤活性，其确切的机制有待于进一步研究。

[1]Boischio A.Developmental neurotoxicity:methylmercury and prenatal exposure protection in the context of the Minamata Convention[J].Rev Panam Salud Publica，2015，38(3):243-247.

[2]Farina M,Aschner M,Rocha JB.Oxidative stress in MeHg-induced neurotoxicity [J].Toxicol Appl Pharmacol, 2011,256(3):405-417.

[3]Sadiq S,Ghazala Z, Chowdhury A,etal.Metal toxicity at the synapse:presynaptic, postsynaptic, and long-term effects[J].J Toxicol，2012,2012:132671-132682.

[4]郭杰,王铁君,张雯艳,等.氯化甲基汞对发育阶段大鼠海马组织蛋白激酶 C 活性的影响[J] 吉林大学学报(医学版),2010,36 (5):922-925.

[5]郭杰,张雯艳 ，王铁君,等.氯化甲基汞诱导大鼠不同发育阶段脑神经细胞凋亡[J].中国免疫学杂志，2013，29(6)596-599.

[6]郭杰，张宏宇，张雯艳,等.氯化甲基汞对仔鼠小脑 PKCα mRNA 表达的影响[J].中国免疫学杂志，2013；29(9)923-925.

[7]柳影,陈儇, 郭杰,等.氯化甲基汞对人SHG44胶质瘤细胞抗肿瘤活性的体外实验研究[J].中国实验诊断学，2010，14(4)：475-478.

[8]Berardi DE, Bessone MI, Motter A,etal.Involvement of protein kinase C α and δ activities on the induction of theretinoic acid system in mammary cancer cells[J].Mol Carcinog，2015,54(10):1110-1121.

[9]Xu B,Xu ZF,Deng Y,etal.MK-801 protects against Intracellular Ca2+overloading and improves N-methl-d-aspartatereceptor expression in cerebral cortex of methylmercury-poisoned rats [J].J Mol Neuro,2013,49(1):162-171.

[10]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].Anal Biochem,1976, 72:248-254.

[11]Yasuyoshi Y,Freesia LH,Hiroki N,etal.Tissue distribution and developmental expression of protein kinase C isozymes[J].J Biol Chem,1994,263(20):9868-9873.

[12]Kunimoto M.Methylmercury induces apoptosis of rat cerebellar neurons in primary culture[J].Biochem Biophys Res Commun,1994,204(1):310-317.

[13]Soh JW,Lee EH,Prywes R,etal.Noval roles of specific isoforms of protein kinase C in activation of the c-fos serum response element[J].Mol cell Biol,1999,19:1313-1324.

[14]Leverrier S,Vallentin A,Joubert D.Positive feedback of protein kinase C proteolytic activation during apoptosis[J].Biochem J,2002,368(Pt 3):905-913.

[15]Romanova LY,Alexandrov IA,Blagosklonny MV,etal.Regulation of actin cytoskeleton in lymphocytes:PKC-delta disrupts IL-3-induced membrane ruffles downstream of Rac1[J].J Cell Physiol,1999,179(2):157-169.

[收稿2016-01-23]

(编辑张晓舟)

Effects of Methylmercury chloride exposure on PKCδ expression in rat developmental cerebellum

ZHANG Hong-Yu，LIU Zhong-Shan，WANG Tie-Jun，LI Zhi-Chao, GUO Jie.Department of Radiotherapy,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China

Objective:To investigate the effect of Methylmercury chloride chronic exposure on PKCδ expression developing cerebellum.Methods: Establishment of cerebellum damage model of developmental rats by chronic MMC exposure.In Situ Hybridization and Western blot analysis were performed to detect the expression of PKC isozyme.Results: PKCδ was expressed at high levels at birth, but no significant change was observed with the increase in the time of birth corresponding to brain Hg2+level, expression of PKCδ in cerebellum of experimental groups was markedly higher than that of control group.Conclusion: Neurotoxicity of Methylmercury chloride exposure might be mediated by PKCδ expression up-regulating in developmental cerebellum.

Methylmercury chloride;Brain development;PKCδ expression

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.024

R135.13文献标志码A

1000-484X(2016)08-1192-03

张宏宇(1972年-)，男，药学硕士，主治医师，主要从事重金属神经毒作用机制的研究，E-mail:xmj770818@sina.com。

及指导教师：郭杰(1973年-),女,博士,副教授,主要从事恶性肿瘤治疗方面的研究, E-mail:guojie@jlu.edu.cn。