复合前列腺特异性抗原的单克隆抗体制备及化学发光法免疫定量检测试剂研究①

詹炉停　温桂平　赵　敏　依　含　刘江武　郭小怡　林海军　黄刘女　夏宁邵　郑子峥

(厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，公共卫生学院，厦门361102)



复合前列腺特异性抗原的单克隆抗体制备及化学发光法免疫定量检测试剂研究①

詹炉停温桂平赵敏②依含②刘江武③郭小怡②林海军③黄刘女③夏宁邵②郑子峥②

(厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，公共卫生学院，厦门361102)

①本文为863计划资助项目(No.2011AA02A101;2012AA02A307) 。

②厦门大学生命科学学院，厦门361102。

③厦门万泰凯瑞生物技术有限公司，厦门361000。

目的：获得特异性检测复合前列腺特异性抗原(c-PSA)的单克隆抗体配对，建立基于化学发光c-PSA免疫定量试剂。 方法：利用市购c-PSA抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，间接法ELISA差异筛选抗c-PSA、游离前列腺特异性抗原(f-PSA)、总前列腺特异型抗原(t-PSA)的抗体，抗体配对后化学发光定量检测血清中c-PSA蛋白。 结果：获得抗体配对1A10/7D6-SAE，经c-PSA标准品及临床血清样本初步筛选，该抗体配对适用于基于化学法发光的免疫反应定量检测试剂的开发；血清阳性样本与阴性样本检测结果显示具有统计学意义(P<0.000 1)；阳性样本定量结果与Siemens公司复合前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)的相关系数为0.97；线性范围为0.1～100 ng/ml；检测灵敏度为0.005 ng/ml。 结论：成功筛选获得特异性检测c-PSA的抗体配对，并开发c-PSA化学发光免疫定量试剂，其检测能力与国际主流试剂相当。

复合前列腺特异性抗原；单克隆抗体；化学发光；定量试剂

前列腺癌(Carcinoma of prostate，PCa)是威胁老年男性健康的主要肿瘤，发病率不断上升，早期诊断是进行根治性治疗的关键[1]。PCa早期诊断和筛检主要靠直肠指检、直肠B超、血清前列腺特异性抗原的检测，结合针刺活检组织病理结果确诊[2]。1979年Wang等从前列腺组织中分离和提纯前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen， PSA)[3]，1980年Papsidero等[4]在晚期前列腺癌患者的血清中检测出PSA，成为前列腺癌筛选的重要指标，广泛应用于临床[5]。但PSA特异性低，在鉴别炎症、良恶性肿瘤上存在一定的误差[6]。血清t-PSA免疫反应性的主要形成物包括游离PSA(Free prostate specific antigen，f-PSA)(20%)和复合PSA(Complexed prostate specific antigen,c-PSA)(80%)[7]。联合t-PSA及f-PSA/t-PSA的比值作为前列腺癌辅助诊断，可一定程度上提高灵敏度和特异性[8]，但f-PSA在血清中含量低、不稳定，容易带来误差，因此，该方法对4～10 ng/ml灰区内的患者仍难以做出确切鉴别诊断[9]。c-PSA主要由PSA与α1抗胰蛋白酶(α1-antichymotrypsin，ACT)结合形成，较f-PSA血清中含量高、稳定。研究表明，c-PSA可提高PCa诊断的灵敏度，与传统的t-PSA及计算f-PSA/t-PSA的比值相比，对前列腺癌的检测准确度有较大提高[10]。因此，c-PSA的定量检测结合t-PSA及f-PSA/t-PSA检测，有助于灰区前列腺癌诊断特异性的提高[11]，减少不必要的活体组织检查[12]。

化学发光免疫诊断技术因其具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点[13]，被广泛应用于生物医药、化学分析等领域中[14]。该诊断技术与全自动化学发光分析仪器相结合，可大大提高医院诊断效率[15]。目前国内尚无特异性检测c-PSA化学发光免疫定量试剂，且国外试剂价格昂贵，不利于大范围的推广。

本研究利用市购c-PSA抗原免疫小鼠，筛选得到c-PSA、t-PSA特异性抗体，进一步通过抗体配对及调试，建立复合型前列腺特异性抗原化学发光定量检测试剂，其与Siemens公司的复合前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)的相关性高，为临床检验及诊断提供良好的依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物BALB/c、F1品系小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室SPF级动物房内，本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2细胞小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0细胞由厦门万泰公司馈赠，培养于含10% 胎牛血清、50 μg/ml青霉素、50 μg/ml链霉素的1640HT培养基(pH7.2)中，5% CO2培养箱中37℃培养。

1.1.3主要试剂及试剂盒弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；优级胎牛血清(FBS)购自德国PAA公司；96孔平底细胞培养板购自美国COSTAR公司；复合前列腺特异性抗原、游离前列腺特异性抗原购自美国Fitzgerald公司；西门子复合前列腺特异性抗原测定试剂盒(直接化学发光法)购自美国西门子公司。

1.2方法

1.2.1动物免疫初次免疫选取6周龄BALB/c雌性小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化后的免疫原c-PSA，剂量为50 μg，体积为200 μl。2周后30 μg的抗原与弗氏不完全佐剂乳化后皮下加强免疫，加强2次后小鼠血清抗体滴度达到平台期，脾脏冲击免疫20 μg，进行融合实验。每次免疫前眼底采血，放置于37 ℃恒温培养箱 30 min，12 000 r/min高速离心 10 min后，取血清-80 ℃保存，利用间接法 ELISA检测血清c-PSA及f-PSA抗体滴度。

1.2.2融合筛选及单克隆抗体制备无菌条件下取小鼠脾脏细胞研磨成脾细胞悬液，使用PEG 1450促进脾细胞与骨髓瘤细胞融合；用c-PSA、f-PSA包板，通过常规酶联免疫吸附法ELISA差异筛选特异性针对c-PSA阳性、f-PSA阳性及t-PSA阳性细胞株，有限稀释法进行克隆化，获得的稳定细胞株扩增、腹腔注射F1品系小鼠腹腔，7 d后收集腹水，硫酸铵沉淀法、Protein A柱纯化得到单克隆抗体。抗体进行12%的SDS-PAGE分析，观察样品纯度。

1.2.3标本相关性分析用45份前列腺癌病患血清样本南京军区福州总医院提供。

1.2.4化学发光法免疫分析采用磁珠法标记包被抗体，吖啶酯法标记检测抗体，室温平衡封闭好的微孔板，加入50 μl磁珠标记1A10抗体和25 μl抗原或待测物及50 μl缓冲液，磁力板上静置室温孵育15 min使磁珠完全吸附，pH7.4含0.05%TWEEN-20的PBS(PBST)洗3次后吸干，加入50 μl 1%吖啶酯标记的抗体缓冲液7D6-SAE 50 μl(1:500)，磁力板上静置室温孵育10 min使磁珠完全吸附，PBST洗3次吸干；微孔板中加入200 μl洗涤液，转移至2 ml玻璃发光管中，磁力板上静置室温孵育10 min使磁珠完全吸附，吸干上清，加入激发A液100 μl，上机检测再加入激发B液100 μl，检测发光值。

1.3数据分析方法采用统计学软件SPSS13.0对检测数据进行统计分析，组间差异采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1c-PSA蛋白、f-PSA蛋白免疫原性的检测市购c-PSA、f-PSA抗原包板，用市购c-PSA抗体ELISA检测抗原的反应性，结果如图1所示，c-PSA与c-PSA抗体具有较好的反应性，表明购买的c-PSA抗原性好。

2.2小鼠多抗血清效价动态分析c-PSA抗原免疫小鼠后通过ELISA检测多抗血清的效价，结果显示(图2)加强免疫两针后血清抗c-PSA的滴度达到平台期，最后一针进行脾脏免疫加强，并进行细胞融合。

图1　c-PSA与f-PSA抗原的鉴定Fig.1　Detection of antigen c-PSA and f-PSA

图2　c-PSA免疫鼠多抗血清监测Fig.2　Immunogenicity of c-PSA in miceNote: Prim.Primary immune;Boost 1.First boost immune;Boost 2.Second boost immune;Fusion.Spleen immune.

2.3单克隆抗体性质鉴定对小鼠开展融合筛选，获得8株单克隆抗体。3株针对c-PSA及5株针对t-PSA，通过c-PSA标准品及阳性临床血清样本的初步筛选，其中单抗7D6、1A10可以较好形成抗体配对进行样品的检测。使用抗体分型检测试剂对单克隆抗体进行分析，其中7D6为IgG 1亚型，1A10为IgG 2b亚型；c-PSA、f-PSA抗原检测单抗的EC50结果如图3所示。

2.4化学发光定量检测试剂的建立及临床应用初步评价

2.4.1定量检测试剂标准曲线的建立利用市购的Siemens公司的c-PSA校准品建立标准曲线，其校准品的浓度梯度为0.05、0.25、2、5、12.5、25、50、100 ng/ml。采用Prism GraphPad 5软件进行4参数拟合分析，2次重复实验的R2为0.998 4、0.998 0(见图4)。

图3　PSA单抗性质鉴定Fig.3　Property identification of PSA antibodiesNote: A.SDS-PAGE of purified mAb7D6 and 1A10;M.Pre-stained protein molecular weight marker;Lane 1.Purified mAb 7D6;Lane 2.Purified mAb 1A10;B.Isotype analysis of mAbs;C.ELISA EC50 test of c-PSA.

图4　c-PSA定量检测试剂标准曲线的建立Fig.4　Calibration curve establishment of c-PSA quantitative detection reagent

表1　灵敏度分析Tab.1　Analytical sensitivity assay

图5　抗体配对临床样品的检测分析及与Siemens试剂的比较Fig.5　Quantification assay of clinical samples and comparability with Siemens′KitNote: A.Scatter plot of clinical samples detection(*.P<0.000 1);B.The correlation analysis of 1A10-7D6-SAE detection and Siemens′ Kit.

2.4.3抗体配对临床样品检测的分析本试剂对45份健康人血清样本及45份前列腺病患组血清样本的c-PSA进行定量分析，与对照组相比病患组血清中的c-PSA显著升高，组间比较差异具有显著的统计学意义(P<0.000 1)。采用Siemens公司的c-PSA直接化学发光试剂盒对45份前列腺病患组血清样本进行定量检测，同时使用本方法对该血清样本进行定量，两种试剂检测的c-PSA定量值取 Log10后进行相关性分析，结果如图5所示，其相关系数达0.97，说明本方法与Siemens试剂检测结果的相关性良好。

3　讨论

血清总前列腺特异性抗原(t-prostate specific antigen，t-PSA)是目前发现最有用的前列腺肿瘤标志物[16]。t-PSA具有极高的器官特异性，但不具疾病特异性[17]。f-PSA在血清中含量低、不稳定，检测结果波动大[18]。因此，依靠检测t-PSA及f-PSA/t-PSA的比值作为辅助诊断具有局限性，难以对重叠部分做出确切鉴别诊断，尤其是4～10 ng/ml这个灰色区域[19]。更多的研究表明，c-PSA可提高PCa诊断的准确度[20,21]，因此，c-PSA检测指标辅助诊断PCa已成为研究热点。研发c-PSA高灵敏度的定量诊断试剂盒具有重要的意义，但目前国内尚无特异性的针对c-PSA反应性好的诊断试剂作为前列腺癌早期检测，只有外购的Siemens公司的直接化学发光检测试剂盒[22,23]，因其价格昂贵，不利于大范围的推广。

本研究采用市购高纯度的c-PSA抗原免疫小鼠，监测血清滴度，待血清滴度达到平台期后脾脏免疫，进行脾细胞与杂交瘤细胞融合，间接法ELISA差异筛选抗c-PSA、f-PSA、t-PSA的抗体并获得多株单克隆抗体。成功得到一对特异性配对抗体1A10-7D6，并建立c-PSA化学发光免疫定量试剂进一步在临床标本上的评估结果显示，使用该c-PSA化学发光免疫定量试剂对病患组及健康人尿液样本的检测结果具有明显的统计学意义(P<0.000 1)；其灵敏度为0.005 ng/ml；线性范围为0.1～100 ng/ml。其与国际主流检测试剂Siemens直接化学发光法检测试剂盒具有很好的相关性(R2)且检测能力相当。

总之，我们获得检测血清中天然c-PSA得特异性单克隆抗体配对，建立化学发光法的检测试剂，临床血清标本初步评估结果显示该试剂具有很好的检测能力，相对于外购，大大降低c-PSA检测成本，有助于国内c-PSA化学发光免疫定量试剂的推广，提高前列腺癌病人辅助诊断效率。

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[收稿2015-12-31修回2016-03-09]

(编辑张晓舟)

Generation of monoclonal antibodies against complexed prostate specific antigen and development of an antibody-based chemiluminescence immune quantifica-tion assay

ZHAN Lu-Ting,WEN Gui-Ping,ZHAO Min,YI Han,LIU Jiang-Wu,GUO Xiao-Yi,LIN Hai-Jun,HUANG Liu-Nü,XIA Ning-Shao,ZHENG Zi-Zheng.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics,School of Public Health,National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases,Xiamen University,Xiamen 361102,China

Objective:To construct a chemiluminescense immune quantification assay based one paired mAbs against complexed prostate specific antigen(c-PSA).Methods: Six week-old female BALB/c mice were immunized with the commercial c-PSA antigen.After serum titer reaching a platform stage,the spleen was immunized and fused with mouse myeloma cell lines(Sp2/0).The hybridoma were screened by indirect ELISA,and eight generated antibodies were paired to obtain a quantitative analysis of the chemical luminescence.Results: 7D6 specifically recognized c-PSA,while 1A10 recognized total PSA(t-PSA).And the paired antibody 1A10/7D6 were determined to successfully construct a chemiluminescense immune response quantitative detection method through the detection of c-PSA standard and clinical serum samples.had,positive samples have statistically significant difference(P<0.000 1)with negative samples.And the correlation coefficient R2was 0.97 between our c-PSA quantitative results and that of the Siemens c-PSA chemiluminescense immunoassay kit.The detection linear range was 0.1-100 ng/ml,and the sensitivity was 0.005 ng/ml.Conclusion: The paired monoclonal antibodies specifically detecting c-PSA were generated and a c-PSA chemiluminescense immunoassay were developed in this study.The detection capability of our method was comparable with that of the international commercial kit.

Complexed prostate specific antigen(c-PSA);Monoclonal antibody;Chemiluminescense;Quantification reagent

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.019

R392.33文献标志码A

1000-484X(2016)08-1171-05

詹炉停(1990年-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤标志物筛查诊断，呼吸道合胞病毒动物模型等方面的研究，E-mail:734873058@qq.com。

及指导教师：郑子峥(1982年-)，男，博士，助理教授，主要从事戊型肝炎病毒及呼吸道合胞病毒感染机制研究，E-mail：zhengzizheng@xmu.edu.cn。