三种不同β受体阻滞剂治疗小鼠血管瘤的实验研究①

徐仙赟　谢琼珺　彭　威③　宁慧婷③　温俊程　王　涛　马靓雯　郝彦斌　刘　潜

(江西省赣南医学院基础医学院，赣州341000)



三种不同β受体阻滞剂治疗小鼠血管瘤的实验研究①

徐仙赟②谢琼珺②彭威②③宁慧婷②③温俊程②王涛②马靓雯②郝彦斌刘潜②

(江西省赣南医学院基础医学院，赣州341000)

①本文为江西省赣鄱英才“555工程”领军人才项目(赣才字[2012]1号)；人力资源与社会保障部2011年度留学人员科技启动项目(赣人社字[2011]474号)、江西省自然科学基金项目(No.2010GZY0016)、江西省青年自然科学基金项目(No. 20142 BAB215026)、江西省教育厅教学改革项目(No. JXJG-14-13-11)、江西省卫生与计划生育委员会中医药科研项目(No. 2014A149)、赣南医学院自然科学研究计划(No.YB201312)、2015年赣南医学院本科生创新项目(ZR2014015、 ZR2014016和 ZR2014017)资助及江西省教育厅科学技术项目(No.150963)。

②同时就职于江西省脉管性疾病临床研究中心(培育)，赣州341000。

③江西省赣南医学院研究生院，赣州341000。

目的：比较三种不同β受体阻滞剂对小鼠血管瘤(EOMA细胞)细胞体内外的影响，初步探讨普萘洛尔对小鼠血管瘤的治疗作用及可能机制，为β受体阻滞剂治疗婴幼儿型血管瘤提供参考。方法：体外培养EOMA细胞，用不同浓度美托洛尔、普萘洛尔、布托沙明作用EOMA细胞，作用24 h。应用MTT法检测细胞存活率、吖啶橙染色检测细胞凋亡情况，观察美托洛尔、普萘洛尔、布托沙明对EOMA细胞体外增殖和凋亡的影响。体内实验将EOMA细胞移植裸鼠，待肿瘤体积生长至100 mm3，将动物随机分为4组，分别为对照组、美托洛尔组、布托沙明组和普萘洛尔组，药物组按2 mg/(kg·d)灌胃给药，对照组给予等体积的生理盐水(NS)，每两天测量肿瘤体积大小。实验结束时收集血清，酶联免疫吸附实验检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平。结果：体外实验显示，普萘洛尔作用24 h后，EOMA细胞存活率随剂量增加逐渐下降， 50 μmol/L时有显著差异(P<0.05)，药物增加至800 μmol/L，细胞存活率接近10%。吖啶橙染色显示50 μmol/L时凋亡细胞显著增多。美托洛尔、布托沙明作用24 h后， 100 μmol/L时细胞存活率与对照组相比有显著差异(P<0.05)， 800 μmol/L时细胞存活率下降至20%，明显高于相同浓度的普萘洛尔组，存在显著性差异(P<0.05)。吖啶橙染色亦出现相似的规律。体内实验显示，实验结束时美托洛尔、布托沙明小鼠和普萘洛尔药物组的肿瘤体积分别为(1 642.8±89.3)、(1 529.3±119.1)和(752.7±46.5) mm3，与对照组小鼠的肿瘤体积(2 023.3±123.07) mm3相比明显减少(P<0.001)。美托洛尔、布托沙明小鼠和普萘洛尔药物组血清中VEGF分别水平为(606.5±105.8)pg/ml、(534.3±243.2)pg/ml和(420.1±123.7) pg/ml，明显低于PBS对照组的[(825.8±145.7) pg/ml,(P<0.05)],TNF-α结果依次是(301.3±62.3) pg/ml、(305.1±53.8) pg/ml和(288.8±59.5) pg/ml,明显低于正常对照组[(444±100.4) pg/ml,(P<0.05)]。结论：三种β受体阻滞剂均可在体外有效抑制小鼠血管瘤EOMA细胞的增殖并促进细胞凋亡普萘洛尔的这一作用较布托沙明和美托洛尔明显。三种β受体阻滞剂不同程度的抑制小鼠血管瘤的生长，其中普萘洛尔的抑制作用明显强于美托洛尔和布托沙明。三种β受体阻滞剂均可降低体内VEGF和TNF-α的水平。提示普萘洛尔对小鼠血管瘤的作用可能与β1和β2受体协同作用有关，其治疗血管瘤的机制可能与VEGF和TNF-α有关。

小鼠血管瘤；β受体阻滞剂；普萘洛尔；凋亡；TNF-α

2008年，Léauté-Labrèze等[1]医生应用普萘洛尔(Propranolol)成功治疗婴幼儿型血管瘤。因其治疗效果显著，较类固醇副作用少，逐渐成为治疗婴幼儿型血管瘤的新选择[2,3]。普萘洛尔是常用非选择性β肾上腺素受体阻滞剂，可用于治疗婴幼儿型血管瘤，其他类型的β肾上腺素受体阻滞剂能否应用于婴幼儿型血管瘤的治疗呢？张艳等[4]使用β1肾上腺素受体阻滞剂美托洛尔、非选择性β肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔和选择性β2肾上腺素受体阻滞剂丁氧胺作用于人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，研究发现β肾上腺素受体阻滞剂可抑制HUVEC细胞增殖和诱导细胞凋亡，同时可下调VEGF和MMP-9的水平。有研究显示，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由角质细胞和巨噬细胞分泌，介导皮肤免疫和炎症的一类细胞因子。当皮肤受到外界因素的影响，分泌大量TNF-α,引起皮肤血管瘤内皮细胞的增殖,从而导致血管瘤的发生。这些研究提示：普萘洛尔等β肾上腺素受体阻滞剂可能也是通过以上的作用方式达到治疗血管瘤的目的。

因此，为探讨不同类型β肾上腺素受体阻滞剂美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明对婴幼儿型血管瘤的作用及可能的机制，本研究以小鼠血管瘤(Murine Hemangioendothelioma Model,EOMA)细胞为模型，体外实验初步比较对三种不同类型β肾上腺素受体阻滞剂对EOMA细胞体外增殖及凋亡调控作用的影响；体内实验比较三种不同类型β肾上腺素受体阻滞剂对血管瘤生长的影响以及体内VEGF和TNF-α的影响，以期探讨β肾上腺素受体阻滞剂对VEGF和TNF-α的调节作用。

1　材料与方法

1.1材料小鼠血管瘤EOMA细胞(重庆医科大学金先庆教授惠赠)。DMSO、MTT、美托洛尔(Metoprolol)、普萘洛尔(Propranolol)和布托沙明(Butoxamine)购自Sigma公司。吖啶橙(AO)购自美国Amerseo公司。胎牛血清、胰蛋白酶等购于Gibco公司，青霉素、链霉素和高糖DMEM培养基等购于北京雷根生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养方法小鼠血管瘤(EOMA细胞)细胞由金先庆教授惠赠。用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的高糖DMEM培养基，在5%CO2，37℃恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2MTT比色法检测细胞增殖/存活率取对数生长期细胞进行实验，将1.0×105个/ml EOMA细胞接种于96孔板中，培养24 h后加入不同浓度美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明PBS溶液：125、250、500、1 000、2 000、4 000和8 000 μmol/L，终浓度分别为12.5、25、50、100、200、400和800 μmol/L，作用时间为24 h。单纯PBS处理作为溶剂对照组。处理结束后，每孔加入20 μl、5 mg/ml MTT溶液，5%CO2、37℃恒温培养箱继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，酶标仪(Thermo)测定A570 nm和A630 nm值。

1.2.3吖啶橙(AO)染色荧光显微观察细胞凋亡于6孔板中放入盖玻片接种EOMA细胞， 100 μmol/L美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明作用24 h。弃上清液，加入10 μg/ml的AO染液1 ml，室温避光染色30 s，弃染液，PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察，常规方法计数，得出凋亡率。

1.2.4动物实验BALB/c雌性裸鼠，4周龄(20±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，[许可证号：SCXK(湘)2009-004]。于小鼠背部皮下注射EOMA细胞1.5×106个/只，每两日测量肿瘤长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积V=1/2×a×b2。当肿瘤体积增长至100 mm3左右时，将小鼠随机分为4组，分别为：生理盐水组(NS组)、美托洛尔组、布托沙明组和普萘洛尔组。每组6只。不同药物组小鼠灌胃给予2 mg/(kg·d)药量，对照组给予等量的生理盐水。灌胃至第30天，处死小鼠，留取血清。

1.2.5血清中VEGF和TNF-α表达水平的检测取各组小鼠血液经离心分离血清，按照ELISA试剂盒说明书，分别进行VEGF和TNF-α的检测。

2　结果

2.1三种不同β受体阻滞剂对EOMA细胞增殖的影响MTT实验观察美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明对EOMA细胞存活率的影响。美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明作用后， EOMA细胞存活率随剂量增加逐渐下降，当美托洛尔和布托沙明药物浓度为100 μmol/L时，与对照组相比存在显著性差异(P<0.05)，浓度增加至800 μmol/L时，EOMA细胞存活率接近50%；普萘洛尔药物浓度为50 μmol/L时存在显著性差异(P<0.05)，继续增加至800 μmol/L时，细胞存活率接近10%。美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明的IC50值分别为382.5、320.8、155.52 μmol/L。见图1。

2.2荧光染色(AO染色法)观察细胞凋亡情况取出100 μmol/L美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明处理24 h后的细胞爬片，按照AO染色法进行荧光染色，荧光显微镜下观察三种不同类型阻滞剂对EOMA细胞凋亡的影响。荧光显微镜下观察可见，美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明作用24 h后，EOMA细胞数量明显减少，且可见细胞体积缩小、固缩，浓缩致密的暗绿色或黄绿色荧光，呈团状或串珠状的凋亡细胞，对照组为均匀一致的绿色荧光。表示正常细胞，AO染色均一，为绿色荧光。表示凋亡细胞。细胞体积缩小、核固缩明显，染色昏暗，见图2。普萘洛尔作用24 h后，细胞数量较美托洛尔和布托沙明组减少，且凋亡细胞数量明显以上两组。

2.3三种β肾上腺素受体阻滞剂抑制肿瘤体积的生长给药前，PBS对照组、美托洛尔组、布托沙明组和普萘洛尔组的平均肿瘤体积分别为(100.8±9.6)mm3、(101.8±7.38)mm3、(100.7±7.5)mm3和(100±6.3)mm3。从给药第4天开始，四组之间的差异开始具有统计学意义。当给药29 d即实验结束时，实验结束时美托洛尔、布托沙明小鼠和普萘洛尔药物组的肿瘤体积分别为(1 642.8±89.3)、(1 529.3±119.1)和(752.7±46.5)mm3，与对照组小鼠的肿瘤体积为(2 023.3±123.07)mm3相比(P<0.01)，经双因素的重复测量数据方差分析，不同分组间比较的F值204.144和P值<0.001，肿瘤体积普萘洛尔组<布托沙明组=美托洛尔组< NS组，即β肾上腺素受体阻滞剂均能明显抑制肿瘤的生长，且普萘洛尔对肿瘤生长的抑制作用最强，其次是布托沙明和美托洛尔，这两者之间没有差别。见图4。

图1　不同浓度美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明对EOMA细胞存活率的影响Fig.1　Effects of metoprolol,propranolol and butoxamine on cell viability in EOMA cellsNote: *.P<0.05，compared with PBS.

图2　AO染色观察美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明对EOMA细胞凋亡的影响(10×20)Fig.2　Effects of metoprolol,propranolol and butoxamine on induction of apoptosis in EOMA cells stained by AO(10×20)Note: A.Ctr(PBS);B.Metoprolol ;C.Butoxa mine;D.Propranolol.

图3　AO染色观察美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明对EOMA细胞凋亡的影响(10×20)Fig.3　Effects of metoprolol,propranolol and butoxamine on induction of apoptosis in EOMA cells stained by AO(10×20)Note: *.P<0.05，compared with PBS；#.P<0.05，compared with Metoprolol,Butaxamine.

图4　三种β肾上腺素受体阻滞剂抑制肿瘤体积的生长Fig.4　Tumor volume in each group

2.4三种β肾上腺素受体阻滞剂降低小鼠血清中VEGF和TNF-α的水平ELISA法检测血清中VEGF的水平结果显示，美托洛尔、布托沙明小鼠和普萘洛尔药物组血清中VEGF分别水平为(606.5±105.8)pg/ml、(534.3±243.2) pg/ml和(420.1±123.7) pg/ml， PBS对照组的(825.8±145.7) pg/ml,经单因素方差分析，其F值=6.558和P值=0.003， (P<0.05)，经SNK法两两比较，得美托洛尔、布托沙明和普萘洛尔与NS组比较存在差异，三种β肾上腺素受体阻滞剂组血清中VEGF水平明显低于NS组，其他组两两比较无差异。见图5。

图5　不同药物组小鼠血清中VEGF表达水平的变化Fig.5　Content of VEGF of serum in each groupNote: *.P<0.05，compared with NS.

图6　不同药物组小鼠血清中TNF-α表达水平的变化Fig.6　Content of TNF-α of serum in each groupNote: *.P<0.05，compared with NS.

TNF-α结果依次是(301.3±62.3) pg/ml、(305.1±53.8) pg/ml和(288.8±59.5) pg/ml,正常对照组(444±100.4) pg/ml 。经单因素方差分析，其F值=6.281和P值=0.004，(P<0.05)，经SNK法两两比较，得美托洛尔、布托沙明和普萘洛尔与NS组比较存在差异，三种β肾上腺素受体阻滞剂组血清中TNF-α明显低于NS组，其他组两两比较无差异。P<0.05，存在明显差异,见图6。

3　讨论

肾上腺素受体主要分布于交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上，分为3种类型， 即β1受体、β2受体和β3受体。均可被β受体阻滞剂所阻断和拮抗。β受体阻滞剂分为三类:第一类为非选择性的，作用于β1和β2受体,常用药物为普萘洛尔(心得安);第二类为选择性的,主要作用于β1受体,常用药物为美托洛尔(倍他乐克)等；第三类也为非选择性的,可同时作用于β和α1受体,常用药物为阿罗洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔。β受体阻滞剂还可以划分为脂溶性或水溶性,以及具有内在拟交感活性或不具有内在拟交感活性等类型[5,6]。

近期，法国Léauté-Labrèze等[1]报道了普萘洛尔治疗婴幼儿型血管瘤的新作用后，其药理作用机制再次引起同行们关注。广义的“血管瘤”指一大类疾病，是儿童时期最常见的“肿瘤”，主要包括血管瘤(真性)及血管畸形两大类[7]，目前普萘洛尔治疗报道多集中于血管瘤(真性)[8]，其与血管畸形的区别主要在于血管内皮细胞等的增殖状态，前者常有异常增殖，而后者增殖状态往往正常。这一区别提示，普萘洛尔治疗血管瘤可能与抑制细胞的增殖有关。

EOMA瘤是一种129P3/J小鼠来源的血管瘤[9]，主要由异常增殖的血管内皮细胞构成瘤体，伴不同程度的管腔化，是目前常用的血管瘤实验动物及细胞培养模型。

体外实验显示，作为选择性β1肾上腺素受体阻滞剂的美托洛尔、选择性β2肾上腺素受体阻滞剂的布托沙明以及非选择性β肾上腺素受体阻滞剂的普萘洛尔处理组细胞增殖状况明显均低于对照组，同时细胞凋亡明显增加，提示以上β肾上腺素受体阻滞剂具有抑制EOMA细胞体外增殖，诱导其凋亡的作用。

以上结果提示：β受体肾上腺素阻滞剂抑制EOMA细胞增殖和诱导其凋亡的作用可能是通过β1和β2受体阻滞剂协同作用完成的。吉毅等[10]研究发现，β肾上腺素受体阻滞剂抑制婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，其作用可能与β肾上腺素受体信号通路有关[11]。这些研究与本课题组的研究结果相似，但是，是否其他非选择β受体阻滞剂也具有相同的药理作用，是否比单一的β1、β2受体阻滞剂具有更强的抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用有待于进一步的研究。

体内动物实验结果显示，三种不同β肾上腺素受体阻滞剂美托洛尔、普萘洛尔和布托沙明均能有效的抑制血管瘤的增长。

β肾上腺素受体阻滞剂可以明显影响免疫炎症因子的释放和调节[12,13]。有研究显示，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是由角质细胞和巨噬细胞分泌，介导皮肤免疫和炎症的一类细胞因子。当皮肤受到外界因素的影响，分泌大量TNF-α,引起皮肤血管瘤内皮细胞的增殖,从而导致血管瘤的发生。本研究发现：三种不同β肾上腺素受体阻滞剂可抑制血管瘤的快速生长，此时，TNF-α表达明显低于血管瘤模型组，与王胜等[14]在血管瘤的快速增生期TNF-α的表达明显高于血管瘤消退期结果相一致。实验发现β肾上腺素受体阻滞剂可降低VEGF的水平，从而达到抑制血管瘤的生长，这些都与国内研究相似。

本研究结果显示，三种β肾上腺素受体阻滞剂均可明显降低血清中VEGF和TNF-α的表达。以上结果提示：三种β肾上腺素受体阻滞剂可能通过调节VEGF和TNF-α水平，从而抑制血管瘤的生长。

综上所述，普萘洛尔对体外EOMA细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的调控作用，可能是通过β1和β2受体协同作用完成的。其可能通过降低VEGF和TNF-α水平，从而抑制血管瘤的生长。

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[收稿2015-10-28修回2016-01-07]

(编辑许四平)

Experimental study of three different β-receptor blockers in treatment on murine hemangioendothelioma

XU Xian-Yun,XIE Qiong-Jun,PENG Wei,NING Hui-Ting,WEN Jun-Cheng,WANG Tao，MA Liang-Wen,HAO Yan-Bin,LIU Qian.Gannan Medical University Bascial Medical College,Ganzhou 341000,China

Objective:To comparison of three different beta blockers on murine hemangioma(EOMA cells) cells in vitro and in vivo effects.Preliminary study on the therapeutic effect of propranolol on vascular tumor in mice and possible mechanisms,provide a reference for beta blockers in the treatment of infantile hemangioma.Methods: Comparative study on the effects of three kinds of different β-receptor blockers---metoprolol,propranolol and butoxamine,on the proliferation and apoptosis of Mouse Hemangioendothelioma Endothelial cell(EOMA cells) was conducted in vitro.EOMA cells were cultured in vitro,randomly divided into different groups,propranolol and timolol were added into the medium respectively,after 24 h intervention.MTT assay and acridine orange staining assay were conducted respectively to detect cell viability and apoptosis level.EOMA cells were transplanted into nude mice in vivo.Tumor volume growth to 100 mm3,animals were randomly divided into 4 groups respectively,the control group,metoprolol group,Bhutto Samin group and propranolol group,drug group according to 2 mg/(kg·d) oral gavage,control group were given an equal volume of saline(NS),every two days measurement tumor volume size.Serum levels of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and vascular endothelial growth factor(VEGF)were detected by enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)in the end of the experiment.Results: For propranolol,after 24 h treatment,significant differences of cell viability and apoptosis were noted(P<0.05) at the concentration of 50 μmol/L,while continuing to increase to 800 μmol/L,the cell survival rate decreased sharply to close to 10%.Acridine orange staining at the 50 μmol/L group after 24 h revealed many apoptotic cells.For metoprolol and butoxa mine,significant differences of cell viability and apoptosis were noted(P<0.05) at the concentration of 100 μmol/L,while continuing to increase to 800 μmol/L,the cell survival rate decreased sharply to close to 20%.It was significantly higher than propranolol group at the same concentration(P<0.05).It showed a similar trend in acridine orange staining.In vivo experiments showed that the end of the experiment of metoprolol,butoxamine group and propranolol drugs in mice tumor volume,respectively(1 642.8±89.3),(1 529.3±119.1) and (752.7±46.5)mm3,significantly lower than the control group of mice tumor volume of (2 023.3±123.0) mm3(P< 0.001).Metoprolol,butoxamine mice and propranolol drugs group,serum VEGF levels for (606.5±105.8) pg/ml,(534.3±243.2) pg/ml and (420.1±123.7) pg/ml， significantly lower than the PBS control group[(825.8±145.7) pg/ml,(P< 0.05)],the TNF alpha result was followed by(301.3±62.3) pg/ml，(305.1±53.8) pg/ml and (288.8±59.5) pg/ml,significantly lower than the normal control group [(444±100.4) pg/ml,P< 0.05].Conclusion: Three kinds of beta-blockers can effectively inhibit EOMA cells proliferation and induce apoptosis in vitro,the role of propranolol more significantly than butoxamine and metoprolol.Three kinds of beta blockers restrain the growth of the hemangioma in vivo,in which the inhibitory effect of propranolol is stronger than the metoprolol and butoxa mine.Three kinds of beta blockers can lower the levels of VEGF and TNF-α in vivo.Indicating that propranolol on vascular tumor in mice may be one of the mechanisms of β1 and β2 receptor synergy effect and its mechanism in the treatment of hemangioma may be associated with VEGF and TNF-α.

Murine hemangioendothelioma;β receptor blocker;Propranolol;Apoptosis;TNF-α

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.08.007

R392.7 文献标志码A

1000-484X(2016)08-1118-05

徐仙赟(1982年-)，男，硕士，实验师，主要从事肿瘤与免疫方面的研究，E-mail:xuxianyun_1982@163.com。通讯作者及指导教师：刘潜(1971年-)，男，博士，教授，主任医师，主要从事婴幼儿型血管瘤等脉管性疾病的研究，E-mail:18907979876@126.com。