HP感染的消化性溃疡伴胃癌前病变与自噬因子的相关性研究

孔繁静　赵　娟



HP感染的消化性溃疡伴胃癌前病变与自噬因子的相关性研究

孔繁静赵娟

目的探讨幽门螺杆菌(helicobacterpylori，HP)感染伴胃黏膜癌前病变与自噬因子LC3B表达水平之间的相关性。方法收集经胃镜及黏膜下活检确诊为消化性溃疡的患者263例，采用半定量RT-PCR方法检测所有患者的自噬因子LC3B 表达水平，同时行碳14呼气试验进行HP检测，分别比较患者的HP阳性检出率与自噬因子LC3B表达水平之间的相关性；以及HP感染的消化性溃疡伴胃癌前病变与自噬因子LC3B表达水平之间的相关度。结果自噬因子LC3B mRNA 高表达与HP检出率呈正相关；自噬因子LC3B mRNA高表达与慢性胃炎伴不典型增生组的发病率呈正相关。结论自噬因子LC3B mRNA高表达与HP感染及消化性溃疡伴胃黏膜不典型增生具有相关性。

幽门螺杆菌；自噬因子；LC3B；幽门螺旋杆菌检测；胃癌前疾病

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.007

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1065～1068)

消化性溃疡是临床消化系统的常见性疾病，自从幽门螺旋杆菌发现以来，消化性溃疡与其之间的关系已被证实，同时HP也是胃癌及胃癌前疾病的一个重要的发病因素，已有不少关于HP与胃癌及胃癌前疾病的研究[1-2]。HP感染的消化性溃疡继发的胃黏膜的损伤以及在此基础上出现的一系列病理改变机制相当复杂，自噬是其中的一个重要的病理调控机制，在炎症调控中扮演着双重角色。自噬作用可以抑制性因子的激活，通过清除内源性刺激物降低炎性反应，同时在自噬缺失的情况下，内源性因子造成炎症激活，增加炎性反应。自噬又是细胞降解细胞质中细胞器和蛋白质的主要途径，长期以来细胞的自噬又被认为是细胞维持稳态的基础，是细胞自救的行为，在各类炎性反应及肿瘤调控上自噬发挥着重要的作用。自噬泡膜上的微管相关蛋白1 轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3B) 是自噬的标志性分子，自噬活动在胃黏膜炎性损伤中被激活，同样调控着胃黏膜的再生和愈合，自噬的分子机制也是当今消化界研究的热点之一[3-4]。消化性溃疡患者根除HP治疗成为各大指南的强烈推荐意见，但是自噬调控与HP感染率以及胃癌前疾病的发病率之间的关系研究较少[3]。本研究通过对他们之间的相关性进行探讨，分析自噬因子的表达水平与HP感染以及不同类型的胃癌前疾病之间关系，现报告如下。

1　材料与方法

1.1一般资料

收集纳入了2014年1月至2015年5月期间的在我院消化科确诊为消化性溃疡的患者263例，其中男性148例，女性115例，平均年龄(46.25±10.23)岁，本研究经医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

1.2入组标准

所有纳入本研究的患者均符合以下入组标准：①年龄在20～75周岁之间的患者；②均进行胃镜检查诊断为上消化道溃疡，包括胃溃疡、十二指肠球部溃疡、复合性溃疡，其中临床表现为伴或不伴有活动性出血；③入院前1周内未服用过任何护胃药及影响幽门螺旋杆菌检查结果的药物，包括抗生素及中药，1个月内未服用过类固醇抗炎药物；④患者没有其他各类系统的严重疾病及肿瘤；⑤均顺利完成胃镜及镜下取活检术；⑥依从性好，并完成问卷调查。

1.3排除标准

出现以下情况予以排除：①年龄不满20周岁，或大于75岁的患者；②有躯体性疾病或者其他系统疾病；③卓-艾氏综合征、有胃手术史、胃癌、食管静脉曲张破裂出血者予以排除；④存在听力、视力疾病，意识不清或精神疾病，有服用过精神科药物病史的患者；⑤有成瘾类药物及酒精使用史的患者。

1.4方法

1.4.1胃镜检查并取活检对纳入研究的患者行胃镜检查，并在检查过程中发现患者存在消化性溃疡，同时行镜下取活检术，病理组织放入福尔马林液中待病理科行病理检查，按照Forrest分级标准进行分级，记录溃疡的形态、大小等特征。

1.4.2碳14呼气试验对所有纳入研究的患者在入组后给予空腹口服尿素14C胶囊，服药30 min后对其进行呼气试验。应用幽门螺旋杆菌检测仪(型号为：HUBT-01)进行HP检测，在护理人员的配合下完成。

1.4.3染色方法对病理标本进行HE染色，采用常规的病理诊断及组织学分型分类分级。对判断为HP阴性的采用Warthin-Starry细菌染色进行进一步确认HP的感染情况以判断有无HP感染。

1.4.4HID-AB(pH2.5)-PAS黏液染色[5]唾液酸黏液染蓝色，中性黏液染紫红色，硫酸黏液染棕黑色。根据黏液染色及形态学标准定义各类胃癌前疾病：肠上皮化生，慢性萎缩性胃炎；胃上皮不典型增生。

1.4.5RT-PCR方法检测自噬因子LC3B 表达水平对纳入研究的患者的胃组织采用RNA提取试剂盒进行RNA提取，采用TaqMan RNA试剂盒检测自噬因子LC3B表达情况。内参校正：RT-PCR反应每个样本量取10 μl的RNA提取量，由于实验测试过程中受到RNA逆转录效率、RNA浓度定量误差以及每个样品等体积的cDNA的含量不同等系统误差的影响，我们采用RNU6作为实验内参。对自噬因子LC3B的表达水平采用二步法进行检测，第一步是通过茎环引物来合成互补DNA，再通过逆转录系统对10 ng RNA进行逆转了反应体系进行反应，在PCR管加入10 μl的逆转录缓冲液，总的RNA浓度调整到2 ng/μl，最后加入5 μl的逆转录引物，在冰上混匀之后反应5 min，接着进行梯度变性反应，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min递减。第二步采用Platinum SYBR Green qPCR的反应体系，反应体系为2×的 PCR Taqman Universal的混合液以及Taqman RNA的特异性引物，通过逆转录体系进行反应，cDNA共5 μl加入到RNA的去酶的水当中，将体积扩增至20 μl，通过循环反应94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72 ℃、7 min递减的扩张40个循环之后，对实验结果进行分析，采用实时定量反应，按照PCR操作说明，Ct的检测值在20～32之外的需要进行第二次检测。应用△Ct=Ct自噬因子LC3B-CtRNU6的计算公式计算自噬因子LC3B的相对表达量。

1.5统计学处理

所有采集的数据应用SPSS 21.0统计软件全部数据建立数据文件，将LC3B表达水平分为2组，小于平均值为低表达组，大于平均值作为高表达组。通过分析LC3B的表达水平高低与发病相关因素分析以逐步回归法筛选有统计学意义的变量，对临床病理因素之间的风险情况采用logistic回归分析，组间比较用方差分析，组间均数比较采用t检验，组间率的比较用卡方检验。应用Mann-whitney U检验法进行两两数据之间比较。具有统计学差异的以P<0.05表示。

2　结果

2.1LC3B的相对表达量与临床特征之间的相关性

LC3B的相对表达量为0.436，95%CI为0.323～0.534，表达量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相对表达量与患者的年龄、性别、发病的部位及黏膜损伤的大小并不存在相关性，P>0.05；而与HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生有关(P<0.05)，见表1。

表1　LC3B的相对表达量与临床特征的相关性

2.2LC3B相对表达量的高低与临床因素之间的关系

采用logistic回归分析LC3B相对表达量的高低与临床因素之间的相关性，LC3B相对表达量与HP感染具有相关性，调整之后风险OR=5.05，95%CI为1.14～23.45，P=0.02，见表2。

表2　LC3B相对表达量的高低与临床因素之间的关系

3　讨论

消化性溃疡是发生在胃十二指肠的急慢性溃疡，是消化系统的常见病和多发病，其形成的原因具有多样化的特点，酸性胃液对黏膜消化作用是消化性溃疡形成的主要因素[6-8]。幽门螺旋杆菌是引发该病发生的主要环节，研究发现消化性溃疡与HP感染密切相关。自从HP被发现以来，对上消化道的研究一直在不断的更新和深入，HP通过损伤上消化道的黏膜层参与疾病的发生发展，且HP感染也是引起消化性溃疡、慢性胃炎、胃癌前疾病甚至胃癌的重要因素，HP感染之后侵犯胃黏膜，使其黏膜屏障的免疫力下降，黏膜变薄且上皮细胞的类型也会发生改变，一些癌前疾病随之发生，机体对HP的自我清除能力也下降，导致HP感染升高，相互影响也在一定程度上提高了上消化道肿瘤的发生率[9-11]。

自噬是多种组织细胞的保护机制，细胞通过降解而形成自噬体，运输到溶酶体从而形成自噬溶酶体，并经过酶的降解消化之后实现某些细胞器的更新和新陈代谢。近年来研究结果显示自噬贯穿在炎症和黏膜损伤修复的整个过程，在胃黏膜的修复中扮演着一个十分重要的角色。自噬与胃黏膜的细胞修复及损伤的相关性是当今的研究热点[12-13]。本研究纳入243例消化性溃疡的患者，入组后均行胃镜检查及胃镜下活检诊断并进行碳14尿素呼气试验方法检测，所有纳入研究的患者均采用半定量RT-PCR方法检测自噬因子LC3B表达水平，同时行碳14呼气试验进行HP检测，分别比较患者的HP阳性检出率与自噬因子LC3B表达水平之间的相关性，以及HP感染的消化性溃疡伴胃癌前病变与自噬因子LC3B表达水平之间的相关度。结果显示，LC3B的相对表达量为0.436，95%CI为0.323～0.534表达量低于平均值的有143例，高于平均值的有120例，LC3B相对表达量与患者的年龄、性别、发病的部位及黏膜损伤的大小并不存在相关性；而与HP感染、胃上皮不典型增生、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生有关，结果提示自噬因子LC3B mRNA 高表达与HP检出率呈正相关；自噬因子LC3B mRNA高表达与慢性胃炎伴不典型增生组的发病率呈正相关。HP感染后，导致胃酸对胃黏膜的损害，使胃黏膜细胞类型变化，肠上皮化生、萎缩性胃炎和不典型增生的胃癌前疾病发病会因为HP的感染导致胃酸分泌的抑制，同时HP感染会产生壁细胞的抑制蛋白，抑制胃酸分泌，因此自噬因子LC3B mRNA 高表达、HP感染及胃癌前疾病的发生三者是相互作用相互影响的。

综上所述，本研究从自噬的角度对HP感染及胃癌前疾病进行临床观察，发现黏膜的不典型增生及HP感染与自噬因子LC3B mRNA 高表达存在密切关系，也初步证明了自噬因子LC3B mRNA高表达与胃癌前疾病确实存在着一定的相关性。本研究结果也提示自噬因子LC3B mRNA高表达对HP感染及胃癌前疾病具有调控作用，提示在胃黏膜恶化的形成过程中，自噬作为胃黏膜修复的重要机制，在治疗中可选择LC3B作为基因治疗的靶点，本研究也为我们提供了基因治疗的新思路。

[1]Takeuchi K，Ohishi M，Ota S，et al.Metabolic profiling to identify potential serum biomarkers for gastric ulceration induced by nonsteroid anti-inflammatory drugs〔J〕.J Proteome Res，2013，12(3)：1399-1407.

[2]刘文忠，萧树东.幽门螺杆菌新国际共识解读〔J〕.胃肠病学，2012，17(1)：1-4.

[3]Chen HC，Fong TH，Lee AW，et al.Autophagy is activated in injured neurons and inhibited by methylprednisolone after experimental spinal cord injury 〔J〕.J Spine，2012，37(6)：470-475.

[4]Kato M，Ono S，Yoshida T，et al.Significance of H.pylori eradication in treatment and prevention for low-dose aspirin induced gastric ulcer of elderly〔J〕.Nihon Rinsho，2010，68(11)：2089-2095.

[5]Naqano Y，Matsui H，Tamura M，et al.NSAIDs and acidic environment induce gastric mucosal cellular mitochondrial dysfunction〔J〕.Digestion，2012，85(2)：131-135.

[6]朱玉群，杨绍徐.幽门螺旋菌感染与胃癌的相关性研究〔J〕.首都医科大学学报，2009，3(17)：49-50.

[7]成积儒，蔡永林，黄德旺，等.336例上消化道疾病患者的幽门螺杆菌抗体谱检测结果分析〔J〕.广西医学，2009，31(6)：807-808.

[8]David S，Kroner A.Repertoire of microglial and macrophage responses after spinal cord injury 〔J〕.J Nat Rew Neurosci，2011，12(7)：388-399.

[9]Kanno H，Ozawa H，Sekiguchi A，et al.Induction of autophagy and autophagic cell death in damaged neural tissue after acute spinal cord injury in mice〔J〕.J Spine，2011，36(22)：E1427-1434.

[10]Boike JR，Kao R，Meyer D，et al.Does concomitant use of paracetamol potentiate the gastroduodenal mucosal injury associated with aspirin?A prospective，randomised，pilot study〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2012，36(4)：391-397.

[11]朱敏，袁昌琼，杨慧英，等.胃肠外疾病患者幽门螺旋杆菌感染治疗探析〔J〕.河北医学，2013，19(12)：1795-1797.

[12]Seo PJ，Kim N，Kim JH，et al.Comparison of indomethacin，diclofenac and aspirin-induced gastric damage according to age in rats〔J〕.Gut Liver，2012，6(2)：210-217.

[13]Tamural I，Fujita T，Tsumura H，et al.Low-dose aspirin-induced gastroduodenal mucosal injury in Japanese patients with arteriosclerotic disease〔J〕.Inter Med，2010，49(23)：2537-2545.

(编辑：甘艳)

Correlation between Precancerous Lesions and Autophagy Factor of HP Infectedwith Peptic Ulcer

KONGFanjing，ZHAOJuan.

JingzhouSecondPeople'sHospital，Jingzhou，434000

ObjectiveTo study the correlation between helicobacterpylori (HP) infection with gastric precancerous lesions and expression of autophagy factor LC3B.Methods263 cases of peptic ulcer patients confirmed by gastroenterology endoscopy and mucosal were selected，all patients included in the study received semi-quantitative RT-PCR method to detect self LC3B bite factor expression levels of carbon-14 breath test simultaneously perform HP detect correlations were compared in patients with HP positive rate of autophagy factor LC3B expression level；and former HP infection with gastric peptic ulcer disease autophagy factor LC3B correlation between the expression level.ResultsThe correlation of autophagy factor LC3B mRNA expression with HP detection rate was positive；autophagy factor LC3B mRNA expression in chronic gastritis with high incidence of dysplasia was positively correlated.ConclusionAutophagy factor LC3B mRNA expression with HP infection and peptic ulcer with gastric dysplasia are relevant.

Helicobacter pylori；Autophagy factor；LC3B；Helicobacter pylori detection；Precancerous disease

434000 湖北省荆州市第二人民医院(孔繁静)；441021 湖北省襄阳市中心医院(赵娟)

赵娟

R735.2

A

1001-5930(2016)07-1065-04

2015-09-07

2016-01-11)