Neuritin对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤影响的研究

李晓天，赵 冬，代林志，朱立仓，田卫东，唐仕军，朱文学，杨 鹏，王业忠



·论著·

Neuritin对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤影响的研究

李晓天，赵 冬，代林志，朱立仓，田卫东，唐仕军，朱文学，杨 鹏，王业忠

目的探究Neuritin对大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤过程中内质网应激因子GRP78及血-脑脊液屏障通透性的影响。方法2014年4月—2015年9月选取成年健康雄性SD大鼠144只，按照随机数字表法分为对照组、假手术组(Sham组)、SAH组、Neuritin组，各36只。再依据简单随机抽样法分别于3、6、12、24、48、72 h抽取每组6只大鼠处死，Neuritin组于处死前1 h采用立体定向技术向侧脑室注射Neuritin。建模后6、12、24、48、72 h处死大鼠前，记录各组大鼠Garcia神经功能评分；建模后3、6、12、24、48、72 h处死大鼠后，采用HE染色观察SAH建立情况，侧脑室微量注射亚甲蓝鉴定Neuritin注射情况；采用Western blotting法检测大鼠大脑皮质内质网应激因子GRP78表达水平；采用甲酰胺浸泡法检测大鼠脑内伊文蓝(EB)含量以评价血-脑脊液屏障通透性。结果SAH组、Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均低于对照组和Sham组(P<0.05)；Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均高于SAH组(P<0.05)。SAH组大鼠大脑表面弥散分布积血，其中在willis环、小脑延髓池及脑干腹侧有大量积血存在。Neuritin组大脑腹面有亚甲蓝循环存在，大脑背面无亚甲蓝，Neuritin侧脑室注射成功。SAH组建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表达水平高于对照组、Sham组(P<0.05)；Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h GRP78表达水平低于SAH组(P<0.05)。SAH组大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h脑组织EB含量均高于对照组、Sham组(P<0.05)；Neuritin组大鼠建模后3、12 h脑组织EB含量高于SAH组，建模后6、48、72 h脑组织EB含量低于SAH组(P<0.05)。结论SAH后早期脑损伤过程中存在内质网应激反应，神经营养因子Neuritin可显著改变内质网应激因子GRP78表达水平，改善早期脑损伤过程中大鼠的神经行为学评分，并对血-脑脊液屏障通透性产生影响。

蛛网膜下腔出血；脑损伤；神经生长因子类；血脑屏障；内质网应激；Neuritin；GRP78

李晓天，赵冬，代林志，等.Neuritin对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤影响的研究[J].中国全科医学，2016，19(24)：2908-2914.[www.chinagp.net]

LI X T,ZHAO D,DAI L Z,et al.Effects of Neuritin in early brain injury after subarachnoid hemorrhage of rats[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2908-2914.

蛛网膜下腔出血( subarachnoid hemorrhage,SAH)是由于脑底或脑表浅部位颅内血管破裂，血液流入蛛网膜下腔而形成[1]。SAH是常见的脑血管疾病之一，尽管内外科治疗方法逐渐改进，但其病死率仍高达30%～50%，且在存活的患者中，33%需要长期生活照顾[2]。最近几年国内外有研究者提出了早期脑损伤(early brain injury，EBI)这一概念，其是指SAH发生后72 h内出现的全脑直接损伤，并指出EBI是SAH患者预后不良的主要因素，EBI包括颅内压升高、脑血流量减少、急性脑血管痉挛、血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)破坏、脑水肿、微循环功能障碍和脑细胞凋亡等[3-4]，而神经元的坏死和凋亡是导致EBI中神经功能损害的关键机制[5-6]。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)，是由一系列细胞代谢变化引起的细胞自我毁灭，是在基因控制下，通过合成特殊蛋白而完成的细胞主动死亡过程，是细胞主要功能性活动之一[7]。目前，已知的诱导细胞凋亡的途径有线粒体途径、死亡受体途径和内质网(endoplasmic reticulum，ER)途径。未折叠或折叠错误的蛋白质在ER上过度积累，导致ER产生应激反应从而激活保护细胞的信号通路，通常称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，又名免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP)，属于热休克蛋白70 (HSP70)家族。GRP78是ER众多的分子伴侣蛋白中最具特征性的一个[8]。在ER应激条件下，GRP78的表达上调非常明显，因而GRP78的诱导表达被广泛作

本研究要点：

目前已知的诱导细胞凋亡的途径有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径，而在蛛网膜下腔出血过程中，是否存在内质网途径介导的细胞凋亡，鲜有文献报道。本研究发现，葡萄糖调节蛋白78(GRP78)作为内质网稳态的感受器，其在蛛网膜下腔出血模型大鼠的表达水平较对照组明显增加，进一步证实了本课题组先前发现的蛛网膜下腔出血后存在内质网途径介导的细胞凋亡。本研究以神经营养因子Neuritin为干预因素，发现其可显著降低蛛网膜下腔出血后GRP78的表达水平，改善蛛网膜下腔出血后大鼠血-脑脊液屏障通透性，并最终改善大鼠蛛网膜下腔出血后神经行为学评分，为临床治疗蛛网膜下腔出血提供新的靶点。

为UPR激活的标志[9]。Neuritin是新近发现的一种与神经可塑性相关的神经营养因子，于神经系统高度表达，可促进神经元突触生长、成熟，防止神经元凋亡[10-11]。有研究表明，Neuritin在脑损伤组织中表达明显增高[12]。本研究通过观察Neuritin在大鼠SAH后EBI过程中对ER应激通路中GRP78及BBB通透性的影响，来探讨其在SAH后EBI中的作用，为今后临床进一步治疗SAH提供依据。

1　材料与方法

1.1实验材料2014年4月—2015年9月选取SPF级成年健康雄性SD大鼠288只，体质量250～350 g，月龄3～4个月[13]。大鼠购自新疆维吾尔自治区实验动物研究中心，许可证号：SYXK(新)2011-0002。动物饲养平均温度26 ℃，湿度40%左右。按照随机数字表法将大鼠分为对照组、假手术组(Sham组)、SAH组、Neuritin组，每组36只。

1.2主要试剂GRP78单克隆抗体购自英国Abcam公司，内参β-actin购自北京中杉金桥生物技术有限公司，伊文蓝(EB)、甲酰胺购自美国Sigma公司。

1.3建模方法

1.3.1SAH组、Sham组、对照组大鼠模型的建立[14-15]采用视交叉前池注血法建立SAH动物模型，将大鼠采用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，分离暴露股动脉并穿刺置管，大鼠取俯卧位固定在脑立体定位仪上，常规消毒铺巾后，沿大鼠颅顶矢状线逐层切开头皮、肌肉，钝性分离骨膜，取冠状缝前5 mm，中线旁开3 mm 处为钻孔点，用电动牙科钻钻孔，暴露额极，用1 ml注射器针头挑破硬脑膜，可见脑脊液流出，将自制PE10导管从额极沿前颅窝底向双耳连线中点送入，进入深度为10 mm，骨蜡封闭钻孔。PE10导管外露端连接1 ml无菌注射器，回抽见清亮脑脊液后，取自体股动脉血0.3 ml，连接PE10导管，在12 s内匀速注入蛛网膜下腔。注射完毕后小心拔出导管，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮，保持大鼠头低位 30 min。Sham组除将自体血换为0.3 ml 0.9%氯化钠溶液注入蛛网膜下腔外，余步骤同SAH组。对照组仅行颅骨钻孔，不予其他任何处理。3组建模后分别按照简单随机抽样法于3、6、12、24、48、72 h抽取6只大鼠处死。

1.3.2Neuritin组不同时间点大鼠模型建立在SAH模型基础上，按照简单随机抽样法于3、6、12、24、48、72 h抽取6只大鼠注射Neuritin，建立Neuritin模型后处死。侧脑室注射Neuritin的具体操作：每6只大鼠在处死前1 h再次进行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，方法同前。麻醉生效后，大鼠取俯卧位固定在脑立体定位仪上，使大鼠头顶部处于水平位，定位右侧侧脑室穿刺点，为冠状缝后侧0.8 mm，矢状缝右侧1.6 mm，钻孔至硬脑膜。微量进样器抽取Neuritin溶液150 μl后，并将微量进样器固定在脑立体定向仪上，在钻孔位置垂直进针至硬膜下4.5 mm，匀速注入(约15 μl/min)，并在 12 min 内注完,留针 5 min 后退针。注射完毕后，骨蜡封闭骨孔，再次消毒，缝合头皮。

1.3.3SAH建模成功标准HE染色见大鼠蛛网膜下腔有积血存在即可证实SAH模型建立成功。

1.4观察指标

1.4.1神经行为学评分于建模后6、12、24、48、72 h处死大鼠前，记录各组大鼠Garcia神经功能评分[16]，共评价6个项目：自主活动、四肢活动对称性、前肢伸展活动、攀爬能力、本体感觉、胡须触碰反射，最高18分，最低5分，得分越低表明大鼠神经功能受损程度越严重。

1.4.2形态学观察对照组、SAH组、Neuritin组于建模后3、6、12、24、48、72 h根据简单随机抽样法分别抽取其中1只大鼠于麻醉后断头取脑，对照组、SAH组于10%甲醛溶液中固定至少24 h，组织石蜡包埋，切片HE染色，光镜下观察；Neuritin组在立体定向下注射微量亚甲蓝于大鼠侧脑室，注射后断头取脑，并进行脑组织甲醛溶液固定切片，以鉴定Neuritin是否注射成功。

1.4.3Western blotting法检测GRP78表达水平4组大鼠处死后取大鼠大脑皮质于-80 ℃冰箱冻存，并于冻存1个月内进行实验。冻存后大鼠大脑皮质总蛋白浓度调至10 mg/ml，上样量总蛋白不超过200 μg(即20 μl)，Western blotting法具体操作方法见文献[17]。应用Quantity one软件进行蛋白条带结果分析。

1.4.4EB标准曲线制备及EB含量〔μg/g(湿重脑组织)〕测定[18]采用电子天平称取EB 5 mg溶于25 ml 甲酰胺中，混匀后取0.3 ml加入5.7 ml甲酰胺中混匀作为第1管，从第1管取3.0 ml加入3.0 ml甲酰胺中混匀作为第2管，从第2管取3.0 ml加入3.0 ml甲酰胺中混匀作为第3管，以此类推共9管，EB的浓度分别为10.000 mg/L、5.000 mg/L、2.500 mg/L、1.250 mg/L、0.625 mg/L、0.313 mg/L、0.157 mg/L、0.079 mg/L、0.040 mg/L，第10管为蒸馏水进行空白对照，60 ℃水浴48 h，然后从每管分别取100 μl置于96孔板中，酶标仪630 nm波长处进行比色，测定不同管的OD值，制作标准曲线。各组大鼠于处死前1 h，分别用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉生效后暴露各组大鼠右侧股静脉，2% EB(0.2 ml/100 g)经右股静脉注入大鼠体内,1 h后0.9%氯化钠溶液经左心室进行心脏灌流,直至右心房流出清澈液体。断头取脑正中剖开,左右大脑半球称重后按1 g/1 ml比例浸入甲酰胺溶液后匀浆,将匀浆液置入60 ℃恒温水浴箱中放置48 h，然后在4 ℃下以10 000 r/min离心15 min(离心半径10 cm)。吸取上清液100 μl置于96孔板中，酶标仪630 nm波长处测定甲酰胺中EB的OD值，即EB含量，并根据其评价BBB通透性。根据标准曲线，定量分析各组大鼠脑组织中EB含量。脑组织EB含量(μg/g)=样品EB含量(μg/ml)×甲酰胺容量(ml)/脑重(g)。

2　结果

2.1各组大鼠Garcia神经功能评分比较4组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SAH组、Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均低于对照组和Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均高于SAH组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2对照组、SAH组、Neuritin组大鼠形态学观察对照组大鼠大脑肉眼观无积血(见图1a，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)，SAH组大鼠大脑表面弥散分布积血，其中在willis环、小脑延髓池及脑干腹侧有大量积血存在(见图1b)，对照组及SAH组大脑HE染色切片见图1c～d。Neuritin组大鼠侧脑室注射亚甲蓝后，肉眼观可见大脑腹面有亚甲蓝循环存在，大脑背面无亚甲蓝(见图1e～f)，固定切片可见侧脑室有亚甲蓝分布(见图1g)，提示Neuritin侧脑室注射成功。

2.3各组大鼠不同时间点GRP78表达水平比较4组建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SAH组建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表达水平高于对照组、Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h GRP78表达水平低于SAH组，差异有统计学意义(P<0.05，见表2、图2)。

2.4各组大鼠脑组织EB含量比较4组大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h脑组织EB含量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；SAH组大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h脑组织EB含量均高于对照组、Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；Neuritin组大鼠建模后3、12 h脑组织EB含量高于SAH组，建模后6、48、72 h脑组织EB含量低于SAH组，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表1　各组大鼠不同时间点Garcia神经功能评分比较±s，分)

注：Sham=假手术，SAH=蛛网膜下腔出血；与对照组比较，aP<0.05；与Sham组比较比较，bP<0.05；与SAH组比较，cP<0.05

表2　各组大鼠不同时间点GRP78表达水平比较±s)

注：与对照组比较，aP<0.05；与Sham组比较比较，bP<0.05；与SAH组比较，cP<0.05

表3　各组大鼠不同时间点脑组织EB含量比较±s，μg/g)

注：EB=伊文蓝；与对照组比较，aP<0.05；与Sham组比较比较，bP<0.05；与SAH组比较，cP<0.05

注：a、b分别为对照组及SAH组肉眼观；c、d分别为对照组及SAH组HE染色切片(×100)；e、f、g分别为Neuritin组侧脑室注射亚甲蓝大脑腹面观、背面观及甲醛溶液脑组织固定切片情况

图1模型建立及鉴定

Figure 1Model building and identification

注：Sham=假手术，SAH=蛛网膜下腔出血

图2各组GRP78表达电泳图

Figure 2Electrophoretogram of the expression level of GRP78 protein in different groups

3　讨论

SAH是神经外科常见病、多发病，具有致死率高、致残率高、患者预后差等特点。在存活的患者中，50%以上的患者存在认知功能障碍和神经学症状，而影响SAH预后的主要原因有脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)和EBI。有临床研究显示，显著改善SAH患者的CVS后，其临床预后并无明显改善[19]。而越来越多的临床研究表明，EBI才是影响SAH患者预后的主要原因，SAH后脑损伤是一个多通路的病理生理学过程，其可导致脑血流(CBF)显著减少，造成急性脑缺血[20-21]，且导致患者预后不良的最重要因素是急性SAH给脑组织带来的不可逆性损伤[22]。因此，笔者认为，脑组织细胞死亡和BBB损伤是EBI过程中的重要环节。

本研究采用Garcia神经功能评分法对大鼠模型进行神经行为学评分，因建模3 h时大鼠麻醉未醒，无法进行Garcia神经功能评分，因此不予以测定。本研究结果显示，SAH组、Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均低于对照组和Sham组，表明SAH后EBI过程中可引起神经功能障碍；Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h大鼠Garcia神经功能评分均高于SAH组，提示Neuritin具有缓解SAH后大鼠神经损伤的作用。

目前，已知的诱导细胞凋亡的途径有线粒体途径、死亡受体途径和ER途径。当细胞受到理化因素刺激时，细胞ER内的稳态环境失衡，进而激活相应的信号通路，引发细胞内一系列反应，称为ER应激。此时未折叠或折叠错误的蛋白质在ER上过度积累，导致ER产生应激反应从而激活保护细胞的信号通路，通常称为UPR[23]。UPR是ER一种应激性的自我保护反应，如果刺激过强或持续过久，UPR不足以恢复和维持ER稳态，则启动程序性死亡，走向细胞凋亡[24-25]。ER有3条保护细胞信号转导通路，分别为PERK通路、ATF6通路、IRE1通路。GRP78是ER稳态的感受器，当ER应激时GRP78与PERK、ATF6、IRE1解离，启动ER应激的3条主要信号转导通路，对细胞进行保护[26]。本课题组在前期的研究中证实，ER应激在自发性SAH后EBI中发挥重要作用[27-28]。本研究结果显示，SAH组建模后3、6、12、24、48、72 h GRP78表达水平高于对照组、Sham组，进一步证明SAH后存在ER应激介导的细胞凋亡，Neuritin组建模后6、12、24、48、72 h GRP78表达水平低于SAH组，表明Neuritin可降低ER应激的发生进而减轻ER应激介导的细胞凋亡。

BBB是一个动态的扩散屏障[29]，EB与血浆蛋白结合可作为BBB损害、血浆蛋白外渗、血管源性脑水肿的定性指标。本课题组采用酶标仪法检测渗入脑组织EB含量，作为判断BBB通透性变化、血管源性脑水肿的定性指标。本研究结果显示，SAH组大鼠建模后3、6、12、24、48、72 h脑组织EB含量均高于对照组、Sham组，表明SAH组存在BBB破坏；建模后6、48、72 h脑组织EB含量低于SAH组，表明Neuritin可改善SAH后BBB通透性的损伤。但Neuritin组大鼠建模后3、12 h脑组织EB含量高于SAH组，原因可能为Neuritin注射本身就是一种损伤，因此具体分子机制有待进一步研究。

虽然本研究发现神经营养因子Neuritin对于大鼠SAH后EBI具有积极作用，可降低ER应激，改善SAH后BBB通透性的损伤，并可改善其损伤后的神经行为情况,但其对BBB通透性改善的具体机制、ER应激通路的具体作用靶点及具体作用机制尚不明确，且其最佳药物浓度尚需明确，需进一步深入研究。Neuritin作为一种新近发现的神经营养因子，是否对SAH后除ER应激介导的细胞通路亦或是其他作用靶点有其他积极作用，还需进一步研究。

综上所述，大鼠SAH后存在ER介导的细胞凋亡，神经营养因子Neuritin可以显著降低ER应激的发生，进而降低ER介导的细胞凋亡，并可改善大鼠SAH后BBB通透性，并最终改善大鼠SAH后神经行为学评分及预后，为临床治疗SAH提供新的靶点。

作者贡献：李晓天进行实验具体实施、资料数据收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；赵冬、代林志、朱立仓、田卫东、唐仕军、朱文学、杨鹏进行部分实验实施、评估及部分资料收集处理；王业忠进行实验质量、数据、资料控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Effects of Neuritin in Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage of Rats

LIXiao-tian,ZHAODong,DAILin-zhi,ZHULi-cang,TIANWei-dong,TANGShi-jun,ZHUWen-xue,YANGPeng,WANGYe-zhong.

DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000;WeifangPeople′sHospital,Weifang261000,China

WANGYe-zhong,DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofShiheziUniversity,Shihezi832000；WeifangPeople′sHospital，Weifang261000,China；E-mail：Wangyz2008@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of Neuritin in endoplasmic reticulum stress factor-GRP78 and blood-brain barrier permeability during the process of early brain injury(EBI)after subarachnoid hemorrhage(SAH)of rats.Methods144 healthy adult male SD rats were selected from April 2014 to September 2015,and they were divided into control group,Sham group,SAH group and Neuritin group with 36 rats in each group,according to random number table method.Then according to simple random number table method,6 rats were selected to be executed from each group at time points of 3,6,12,24,48,72 h respectively and lateral ventricle injection with Neuritin was given to rates in Neuritin group by stereotactic technique 1 h before execution.6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological score of rats in each group was recorded before their execution;3,6,12,24,48,72 h after modeling,HE staining was used to observe the SAH establishment situation,Meilan was microinjected into lateral ventricles to identify Neuritin injection condition.we detected the protein expression of endoplasmic reticulum stress factor GRP78 in cerebral cortex of rats by Western blotting method,and the Evans blue (EB) content in brain of rats by formamide immersion method to evaluate the blood-brain barrier permeability.Results6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological scores of rats in SAH group and Neuritin group were lower than those of control group and Sham group (P< 0.05);6,12,24,48,72 h after modeling,Garcia neurological score of rats in Neuritin group was higher than that of SAH group (P< 0.05).Hematocele was scattered in the surface of brain of rats in SAH group,and there also was large amount of hematocele in willis ring,cerebellar medulla and ventral brainstem.Meilan circulated around the ventral side of the brain of rats in Neuritin group,while no Meilan in the reverse side of the brain.Intracerebroventricular injection of rats in Neutritin group was succeeded.3,6,12,24,48,72 h after modeling,GRP78 expression level of rats in SAH group was higher than that of control group and Sham group (P< 0.05);6,12,24,48,72 h after modeling,GRP78 expression level of rats in Neuritin group was lower than that of SAH group (P< 0.05).3,6,12,24,48,72 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in SAH group was higher than that of control group and Sham group (P< 0.05);3,12 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in Neuritin group was higher than that of SAH group (P< 0.05),6,48,72 h after modeling,EB content of brain tissue of rats in Neuritin group was lower than that of SAH group (P< 0.05).ConclusionThere are endoplasmic reticulum stress responses in the process of EBI after SAH.Neurological factor Neuritin can significantly change the protein expression of endoplasmic reticulum stress factor GRP78,improve the neurobehavioral scores of rates in EBI process,and influence the blood-brain barrier permeability.

Subarachnoid hemorrhage;Brain injury;Nerve growth factors;Blood-brain barrier;Endoplasmic reticulum stress;Neuritin;GRP78

国家自然科学资金资助项目(81360185)

832000新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院神经外科(李晓天，赵冬，代林志，朱立仓，田卫东，唐仕军，朱文学，杨鹏，王业忠)；潍坊市人民医院(李晓天)

王业忠，832000新疆石河子市，石河子大学医学院第一附属医院神经外科；E-mail：Wangyz2008@126.com

R 743.35

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.008

2015-12-23；

2016-06-13)