PDL1Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

李 鹏， 李恒平， 周 东， 丁正华， 黄卫东， 王 俊， 张玉毅

(湖北医药学院附属襄阳医院1普外科，2妇产科，湖北襄阳441000)

PDL1Ig基因修饰的骨髓间充质干细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

李 鹏1， 李恒平1， 周 东1， 丁正华1， 黄卫东1， 王 俊1， 张玉毅2△

(湖北医药学院附属襄阳医院1普外科，2妇产科，湖北襄阳441000)

目的:探讨程序性死亡因子配体1免疫球蛋白(PDL1Ig)基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)抑制大鼠原位肝移植免疫排斥反应的机制。方法:培养并鉴定大鼠的BMSCs，重组腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测转染后BMSCs中PDL1Ig的蛋白表达。混合淋巴细胞反应检测未转染和转染后的BMSCs对外周血T淋巴细胞活力的抑制作用。以雄性Wistar大鼠为供体，以雄性SD大鼠为受体，采用改良的两袖套法进行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型。随机分为对照组、BMSCs治疗组、空载体BMSCs治疗组(BMSCs/GFP)和转基因治疗组(BMSCs/PDL1Ig)，每组10对。每组随机取5只于术后第7天处死，检测外周血白细胞介素(IL)-2、IL-4和干扰素γ(IFN-γ)水平，检测肝功能情况，光学显微镜下观察移植肝的病理学变化，另外5只观察生存情况及时间。结果:重组pAdEasy-1/PDL1Ig感染BMSCs 72 h后，BMSCs中有PDL1Ig的蛋白表达。BMSCs/PDL1Ig抑制淋巴细胞活力的作用强于BMSCs/GFP。BMSCs/PDL1Ig组的IL-4水平明显高于其它3组，IL-2和IFN-γ水平也明显降低(P＜0.05)。各实验组移植后7 d检测肝功能，发现BMSCs/PDL1Ig组的肝功能改善最明显，ALT、AST和TBil基本达到正常水平，与对照组比较差异有统计学显著性，与BMSCs治疗组和空载体BMSCs治疗组比较差异也有统计学显著性。肝组织病理检查结果显示对照组移植肝发生了重度排斥反应，BMSCs治疗组和空载体BMSCs治疗组移植肝亦发生排斥反应，但与对照组比较程度较轻，BMSCs/PDL1Ig组移植肝几乎没有排斥反应，受体存活时间大部分超过100 d，显著长于其它3组(P＜0.05)。结论:PDL1Ig修饰的BMSCs可抑制大鼠肝移植排斥反应，诱导肝移植免疫耐受，其效果优于BMSCs单用。

肝移植;免疫耐受;腺病毒;骨髓间充质干细胞;程序性死亡因子配体1免疫球蛋白

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种多能干细胞，具有多向分化潜能和免疫调节作用，可有效延长移植物的存活时间。程序化死亡因子配体免疫球蛋白(programed death ligand-1 immunoglobulin，PDL1Ig)属于B7家族成员，主要在抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)、实质器官(心脏、胎盘和肺)、炎症反应细胞及恶性肿瘤细胞中表达，介导免疫负调控，通过阻止第二信号通路抑制T淋巴细胞的激活，抑制机体对自身抗原的不适度应答，在维持中枢和外周免疫耐受中发挥着重要作用，近来在器官移植免疫中研究较多［1］。由于存在其它第二信号通路，单纯应用PDL1Ig往往不能维持移植物长期存活，研究表明外源基因容易转染BMSCs并能稳定表达，并且不影响BMSCs的功能和状态［2-4］。本实验用重组腺病毒pAdEasy-1/PDL1Ig转染BMSCs，探讨其对同种异体肝移植急性排斥反应的抑制作用。

材料和方法

1 动物

成年雄性SD大鼠和Wistar大鼠各40只，体重250 g，由我院实验动物中心提供。大鼠肝移植相关药品、器械由本室提供。

2 主要试剂

检测IL-2、IL-4和IFN-γ的ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);重组pAdEasy-1/ PDL1Ig病毒液(已在前期工作中构建完毕，构建方法详见本课题组已发表的文献［5］);CCK-8细胞活力检测试剂盒(Roche);Western blot试剂盒和胎牛血清(HyClone);L-DMEM培养基和 0.25%胰蛋白酶(Gibco)。流式细胞仪(Beckman Coulter);倒置显微镜和U-RFLT50显微光源系统(Olympus)。

3 主要方法

3.1 BMSCs的分离、培养和鉴定 取出生7 d的SD大鼠脱颈椎处死，分离股骨与胫骨，用LG-DMEM培养基反复冲洗髓腔直至骨质呈白色，移入培养瓶中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。24 h后更换培养液，去除漂浮的细胞及其它组织，以后每隔3 d更换1次培养液，培养细胞接近80%融合后，用0.25%胰酶消化，传代培养，传至第20代细胞后，离心沉淀细胞，弃去上清液，加入PBS用吸管重浮，转移到10 mL离心管以相同方法再离心，重复3次。倒置显微镜下计数充分清洗后的细胞，PBS稀释法将细胞浓度降低到1×1010/L，取标准无菌的流式管，每个加入100 μL细胞悬液和5 μL标记的细胞表面抗原(CD29、CD34、CD45和CD90)，混匀后放置在4℃冰箱内，避光孵育30 min后离心收集底层细胞，将制备好的样品用流式细胞术检测其抗原表达。

3.2 重组pAdEasy-1/PDL1Ig转染BMSCs及目的蛋白表达的检测 按感染复数(multiplicity of infection，MOI)=200的浓度用重组pAdEasy-1/PDL1Ig病毒液转染BMSCs，转染率达到90%，37℃、5%CO2的恒温培养箱内培养72 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，将4×106细胞用生理盐水1 mL重悬。提取细胞总蛋白，采用Western blot法检测转染后BMSCs 中PDL1Ig的蛋白表达，使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白。

3.3 基因转染后BMSCs的鉴定 使用流式细胞术检测转染后BMSCs的表面标记物CD29、CD90、CD34 和CD45;体外诱导BMSCs的成骨、成脂肪分化，将第20代细胞加入培养基中以每孔1×105的密度接种到6孔板。24 h后加入诱导介质。成骨诱导介质为L-DMEM，含10%胎牛血清、10 mmol/L β-磷酸甘油、100 nmol/L地塞米松和0.2 mmol/L抗坏血酸。成脂诱导介质为L-DMEM，含10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤和60 μmol/L吲哚美辛。每周换液2次。诱导2周后分别用茜素红和油红O溶液染色来检测骨细胞中的矿物质沉淀和脂肪组织中的中性脂肪滴。

再次，《知识产权基本法》需要以“开放互惠”为视野。在国际知识产权规则加快变革的历史背景下，迫切需要以积极推动建立知识产权全球治理新结构为方向，打击知识霸权、促进知识产权发展的多样性，积极抵制垂直论坛转移、总结推广知识产权发展的“中国模式”、提出知识产权国际战略，推动形成全面开放新格局。因此，《知识产权基本法》不仅是严格保护知识产权的实现法、有效激励创新发展的促进法，还需要成为提高知识产权国际竞争力、引导知识产权国际规则发展的范式立法例，成为发展中国家知识产权制度的示范法。

3.4 混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR) 以Wistar大鼠脾细胞为刺激细胞，SD大鼠T细胞为反应细胞，一组加入BMSCs，另一组加入转染过PDL1Ig的BMSCs，作单向混合淋巴细胞实验，采用CCK-8试剂盒，检测T淋巴细胞的活力。

3.5 实验动物模型的建立与分组 以近交系Wistar雄性大鼠为供体，以雄性SD大鼠为受体，体重约250 g，各40只。采用改良的Kamada两袖套法进行原位肝移植，建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型［5］。40只受体大鼠随机分为4组，各10只，分为对照组(control;肝移植时不使用任何干预措施)、BMSCs治疗组、空载体BMSCs(BMSCs/GFP)治疗组和转PDL1Ig基因BMSCs(BMSCs/PDL1Ig)治疗组。以上分组在肝移植时均由门静脉输注。每组大鼠术后第7天随机取出5只检测外周血白细胞介素(interleukin，IL)-2、IL-4、干扰素(interferon，IFN)-γ水平和肝功能情况。第9天处死后石蜡包埋肝组织切片，用苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

4 统计学处理

采用SPSS 22软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示，4组间均数的两两比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。绘制4组大鼠的Kaplan-Meier生存曲线，通过log-rank检验比较各组生存时间。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 BMSCs的培养、鉴定及体外诱导BMSCs成骨、成脂肪分化

BMSCs通过不断传代得以纯化，但在20代以后，部分细胞生长逐渐缓慢，呈成纤维细胞样细胞，宽大扁平，有的呈多角形或长梭形，传代周期延长，培养上清中细胞裂片增多，见图1。选择 CD29、CD34、CD45和 CD90使用流式细胞术对第20代BMSCs进行表面标记物检测，结果显示细胞高表达CD29和CD90(98.6%和99.7%)，低表达造血干细胞系的标志物CD34和CD45(1.8%和5.0%)，见图2。成骨诱导培养3 d，细胞体积增大，呈短梭形，诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多。第14天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积。第21天，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节。成脂诱导72 h后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红染色显示有大量脂质沉淀，可见红色深染的大量脂滴，说明脂肪细胞生成，说明具有成骨和成脂的能力，见图3。

重组 pAdEasy-1/PDL1Ig转染 BMSCs 72 h后，Western blot法检测转染后 BMSCs中 pAdEasy-1/ PDL1Ig的蛋白表达结果见图4A。pAdEasy-1/PDL1Ig转染BMSCs 72 h后的裂解液中检测到分子量约为35.5 kD的特异性条带，符合PDL1Ig蛋白质分子量，表明重组pAdEasy-1/PDL1Ig转染BMSCs后，可表达目的PDL1Ig。转染后可见绿色荧光也提示目的基因在BMSCs中的表达，见图4B。

Figure 1.Cultured bonemarrow mesenchymalstem cells (×100).图1 骨髓间充质干细胞的培养

Figure 2.The surface markers of BMSCs were detected by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90，and low expression of CD34 and CD45.图2 流式细胞术检测骨髓间充质干细胞的表面标志物

Figure 3.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs(×200).图3 BMSCs的成脂和成骨分化

3 转染后的BMSCs的“干性”和“多能性”鉴定

使用流式细胞术对转染后的骨髓间充质干细胞表面标记物检测，细胞高表达CD29和CD90(97.3% 和99.1%)，低表达造血干细胞系的标志物CD34和CD45(2.1%和4.8%)，见图5。诱导其出现成骨和成脂分化，证实转染后的骨髓间充质干细胞仍为骨髓间充质干细胞，见图6。

Figure 4.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs transfected with pAdEasy-1/PDL1Ig determined by Western blot(A)and green fluorescent protein observation(B，×200).图4 Western blot和绿色荧光蛋白观察重组pAdEasy-1/PDL1Ig转染BMSCs后PDL1Ig蛋白的表达

Figure 5.The surface markers of BMSCs/PDL1Ig were analyzed by flow cytometry with high expression of CD29 and CD90 and low expression of CD34 and CD45.图5 流式细胞术检测转染后骨髓间充质干细胞的表面标志物

Figure 6.The adipogenic(A)and osteogenic(B)differentiations of the BMSCs after transfected with pAdEasy-1/ PDL1Ig(×200).图6 BMSCs/PDL1Ig成脂和成骨分化

4 转染前后BMSCs抑制外周血淋巴细胞活力的比较

重组PDL1Ig转染BMSCs 72 h后，混合淋巴细胞反应检测其抑制淋巴细胞活力的作用分别为90.5%，未转染的BMSCs为42.3%，转染后的抑制淋巴细胞活力的作用增强(P＜0.05)，见图7。

Figure 7.BMSCs inhibited the viability of T-lymphocytes in peripheral blood detected by mixed lymphocyte reaction (MLR).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs BMSCs.图7 混合淋巴细胞反应检测未转染和转染后的BMSCs对外周血T淋巴细胞活力的抑制作用

5 大鼠肝移植术后生存情况、生存时间的比较

Control、BMSCs、BMSCs/GFP及 BMSCs/PDL1Ig组大鼠肝移植术后存活时间分别为(10.0±4.1)d、(23.4±4.0)d、(23.1±3.9)d和(100.0±5.0)d。BMSCs/PDL1Ig组的术后表现均较前3组良好，该组动物在术后7 d时无明显黄疸，活动量正常，进食及饮水正常，活动敏捷，体重有增加，接近术前正常状况，大部分大鼠存活超过100 d，显著长于其它3组(P＜0.05);BMSCs组和BMSCs/GFP组的受鼠存活时间也明显长于control组(P＜0.05)，BMSCs组与BMSCs/GFP组受鼠之间存活时间的差别无统计学显著性。Kaplan-Meier生存曲线的比较见图8。

6 大鼠肝移植术后外周血细胞因子水平的比较

与control组比较，BMSCs组和BMSCs/GFP组的IL-4水平明显升高，差异均有统计学显著性(P＜0.05)，但BMSCs组和BMSCs/GFP组之间的差异无统计学显著性，BMSCs/PDL1Ig组的IL-4水平明显高于其它3组，差异均有统计学显著性(P＜0.05)。与control组比较，BMSCs组和BMSCs/GFP组的IL-2 和IFN-γ水平明显降低(P＜0.05)，但BMSCs组和BMSCs/GFP组的IL-2和IFN-γ水平相近，差异无统计学显著性。BMSCs/PDL1Ig组的IL-2和IFN-γ的水平明显低于其它3组，差异均有统计学显著性(P＜0.05)，见表1。

Figure 8.Kaplan-Meier survival curves showed rat survival time of the 4 groups.图8 4组大鼠的Kaplan-Meier生存曲线

表1 各实验组大鼠肝移植术后细胞因子水平的比较Table 1.Comparison of serum cytokine levels of the rats in the 4 groups after liver transplantation(ng/L.Mean±SD.n=5)

7 肝移植术后肝功能的检测

在各实验组肝移植后第7天检测肝功能，发现BMSCs组和BMSCs/GFP组的肝功能有改善，总胆红素和转氨酶均明显下降，与control组比较差异有统计学显著性(P＜0.05)，两组之间比较差异无统计学显著性。BMSCs/PDL1Ig组的肝功能改善最明显，在术后7 d肝功能指标基本达到正常水平，与其它2组比较差异均有统计学显著性(P＜0.05)，见表2。

表2 各实验组肝移植受体术后7 d的肝功能检测Table 2.The liver function of the recipients after 7 d of liver transplantation(Mean±SD.n=5)

8 大鼠肝移植术后病理学检查结果的比较

肝移植术后第9天，肝组织病理学检查结果显示control组为重度典型的排斥反应，表现为肝细胞排列紊乱，部分肝细胞变性坏死，汇管区大量淋巴细胞和嗜酸细胞浸润，胆管炎症破坏，中央静脉炎症细胞浸润，中重度静脉炎，部分肝实质出现坏死区域。BMSCs组和BMSCs/GFP组的移植肝亦发生排斥反应，部分属于轻度排斥反应，炎症细胞浸润少数汇管区的胆管和血管，数量较少，但与control组比较程度较轻。BMSCs/PDL1Ig组的炎症反应最轻，几乎无移植排斥反应，肝小叶结构排列整齐，类似正常肝组织，偶尔仅在汇管区间隙见到少量的淋巴细胞或中性粒细胞，见图9。

Figure 9.The pathological changes in liver tissues of the rats in the 4 groups on the 9th day after transplantation(HE staining，×100).图9 4组大鼠术后第9天的肝组织病理学变化

讨论

骨髓间充质干细胞是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞，有多向分化潜能，其表面少量表达主要组织相容性复合体MHC-Ⅰ类分子，不表达Ⅱ类分子、B7、CD40L等第二信号分子，具有低免疫原性，不刺激T淋巴细胞的增殖和分化［6］。BMSCs可分泌肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、转化生长因子TGF-β1、IL-10等可溶性分子，抑制T淋巴细胞的激活［7-8］，可诱导辅助性T(T helper，Th)细胞向Th1/Th2细胞分化偏离，使Th2细胞比例增多，IL-2和IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，调节免疫的功能［9-10］。BMSCs还可通过直接接触和分泌负性调节细胞因子抑制APC的作用，多项体外、体内实验显示，BMSCs可向肝细胞分化，修复受损肝组织。BMSCs还可被外源基因转染并表达外源基因，且其免疫调节作用、损伤修复作用、分化作用不受影响，这些功能对减轻移植器官的排斥反应有一定的作用［11-12］。

本研究中，体外混合淋巴细胞反应实验发现，BMSCs能抑制淋巴细胞活力，转染PDL1Ig后的BMSCs抑制淋巴细胞作用更强。采用BMSCs可使原位肝移植急性排斥反应模型大鼠的生存时间延长，机体内IL-2和IFN-γ水平较对照组下降，IL-4水平较对照组升高，术后肝脏病理学检查结果显示排斥反应程度减轻，转染PDL1Ig后的BMSCs以上作用更强。因此，本研究证实了在体内、体外BMSCs均可抑制同种异体肝移植排斥反应的发生［13］，器官移植排斥反应有多种机制参与，对其中一种机制的干预往往不能起到明显的抑制排斥反应的理想效果，要想达到免疫耐受，我们认为需要涉及多条路径［14-15］。研究发现BMSCs有明确的抑制排斥反应的作用，但也有向肿瘤组织分化的可能，具有一定风险，其表面的Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)结合配体后可导致其抑制T淋巴细胞的作用消失;另外BMSCs表达MHCⅠ类分子，在与供、受体MHC不符时，亦可激活CD8+T淋巴细胞，造成移植器官损伤［16］。因此，单独应用BMSCs往往不能达到理想的移植免疫耐受的效果。排斥反应主要是由T淋巴细胞介导完成的，根据Lafferty的“双信号”理论，T淋巴细胞的充分激活需要第一信号和第二信号的共同作用才能完成。研究表明，若缺乏第二信号，T淋巴细胞的IL-2产量明显减少，仅为双信号作用时的1/30［17］。目前研究最明确的第二信号通路为CD28-B7通路，PDL1Ig可有效阻断CD28-B7通路，对减轻器官移植术后排斥反应有明确的作用［5］。本研究认为共刺激通路阻断联合骨髓间充质干细胞诱导免疫耐受的可能机制在于BMSCs作为外源抗原，会被受体免疫系统攻击消耗一部分，难以完全发挥免疫抑制作用，重组腺病毒 PDL1Ig转染 BMSCs后，利用其表达的PDL1Ig阻断第二信号通路而达到的免疫抑制作用可以保护BMSCs不受侵害，延长其体内生存期，最终创造出了1+1＞2的负性免疫应答调节效果，达到了大鼠肝移植免疫耐受，为指导临床肝移植免疫耐受提供了新的思路。

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(责任编辑:陈妙玲，罗 森)

PDL1Ig gene-modified BMSCs induce immune tolerance in rat liver transplantation

LI Peng1，LI Heng-ping1，ZHOU Dong1，DING Zheng-hua1，HUANG Wei-dong1，WANG Jun1，ZHANG Yu-yi2

(1Department of General Surgery，2Obstetrics and Gynecology Department，The Affiliated Xiangyang Hospital，Hubei Medical College，Xiangyang 441000，China.E-mail:sharpfast@sina.com)

AIM:To investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)modified by programed death ligand-1 immunoglobulin(PDL1Ig)gene on immune rejection of orthotopic liver transplantation in rats.METHODS:Rat BMSCs were cultured and identified.The protein expression of PDL1Ig in the BMSCs 72 h after infection with pAdEasy-1/PDL1Ig was detected by Western blot.Mixed lymphocyte reaction was used to detect the inhibitory effect of BMSCs on the viability of T-lymphocytes in peripheral blood.The male Wistar rats were used as donors(n=40)，and the male SD rats were used as recipients(n=40).The rat model of orthotopic liver transplantation was established by improved cuff method for observing acute rejection.The rats were randomly divided into control group，BMSCs treatment group，BMSCs/GFP treatment group and BMSCs/PDL1Ig treatment group with 10 pairs each.Five rats were executed at the 7th day and the remains were used for measuring the survival time.RESULTS:The expression of PDL1Ig in the BMSCs was detected after pAdEasy-1/PDL1Ig infection.The effect of BMSCs/PDL1Ig on the viability of the lymphocytes was stronger than that of BMSCs/GFP.The level of IL-4 in BMSCs/PDL1Ig group was significantly higher than that in the other 3 groups，while the levels of IFN-γ and IL-2 were significantly decreased.The liver function in BMSCs/PDL1Ig group was significantly improved and the levels of ALT，AST and TBil were almost recovered to normal at the 7th day after transplan-tation.Severe rejection reaction was observed in control group，and rejection reactions were decreased with different degrees in BMSCs treatment group and BMSCs/GFP treatment group.Much slighter rejection reaction and significantly longer survival time were showed in BMSCs/PDL1Ig group than those in the other 3 groups.CONCLUSION:PDL1Ig-modified BMSCs inhibit the rejection of liver transplantation in rats and induce the immune tolerance，and the effect is better than that of BMSCs alone.

Liver transplantation;Immune tolerance;Adenovirus;Bone marrow mesenchymal stem cells; Programed death ligand-1 immunoglobulin

R392.4;R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.020

1000-4718(2016)07-1279-06

2015-12-24

2016-05-10

△Tel:0710-3420052;E-mail:sharpfast@sina.com