内源性一氧化氮合酶抑制物上调4周运动大鼠骨骼肌收缩功能和线粒体生物合成*

邱 霓， 方伟进， 李 聪， 李晓媚， 熊 燕

(广州医科大学药学院，广州蛇毒研究所，广东广州511436)

内源性一氧化氮合酶抑制物上调4周运动大鼠骨骼肌收缩功能和线粒体生物合成*

邱 霓， 方伟进， 李 聪， 李晓媚， 熊 燕△

(广州医科大学药学院，广州蛇毒研究所，广东广州511436)

目的:观察内源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物非对称性二甲基精氨酸(ADMA)及其信号通路在4周运动大鼠NO水平及骨骼肌收缩功能与线粒体生物合成中的调节作用。方法:建立4周运动大鼠模型，检测离体比目鱼肌对电刺激的单次、强直和疲劳收缩的最大张力;并检测骨骼肌中ATP和线粒体DNA含量以及过氧化物酶增殖体受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子(NRF)mRNA的表达以反映线粒体生物合成及功能;用高效液相色谱测定血清ADMA浓度;用Western blot法检测骨骼肌中内源性ADMA生成酶PRMT1和ADMA代谢酶DDAH 2种亚型以及NOS 3种亚型蛋白的表达;用比色法测定NOS活性及一氧化氮(NO)含量等。结果:与正常对照组相比，运动组大鼠比目鱼肌对电刺激诱导的各种收缩张力均明显增强，比目鱼肌ATP含量、线粒体DNA含量和PGC-1α、NRF mRNA增加显著(P＜0.01)。运动组大鼠比目鱼肌中构成型NOS(cNOS)的蛋白表达及其NOS活性明显上调(P＜0.01)，而NO含量仅小幅增加(P＜0.05);同时，4周运动增加大鼠血清ADMA浓度，并伴有骨骼肌DDAH2表达下调。结论:短期耐力运动增强比目鱼肌单次收缩、强直收缩和抗疲劳收缩肌功能，其机制可能与过度增加的cNOS促使ADMA水平反馈性升高，从而维持骨骼肌NO低幅度增加，促进线粒体生物合成有关。

耐力运动;骨骼肌;收缩功能;一氧化氮;线粒体生物合成

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种气体分子，已被证实广泛参与机体心血管、免疫、神经系统的生理、病理信号调节，如松弛血管平滑肌、增加血流量、阻碍血小板聚集黏附、参与机体抗感染、抗炎症及增加认知记忆等［1］。然而NO对骨骼肌功能的调控却具有双面性:一方面适量或“低浓度”的NO增加骨骼肌内血流量，促进骨骼肌对葡萄糖的摄取、利用，增加骨骼肌的收缩能力;另一方面过量或“高浓度”的NO则可与线粒体产生的超氧阴离子形成过氧硝酸根离子，导致骨骼肌内线粒体呼吸受到抑制，肌肉收缩能力降低，产生运动性疲劳［2-3］。

在体内NO是由其前体L-精氨酸(L-arginine，LArg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下转化而来。NOS作为生成NO的重要限速酶，它的表达及活性都影响组织中NO的含量;已知NOS 有3种亚型，即神经元型 NOS(neuronal NOS，nNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)和诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)，前2种又合成为构成型NOS(constitutive NOS，cNOS)。这3种亚型的NOS在骨骼肌中均表达但不尽相同，有研究报道，eNOS主要在骨骼肌的I型肌纤维高表达，而nNOS则主要表达于II型肌纤维［4］。机体存在一种调节NO合成的内源性机制，即L-Arg的同系物——非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)可与L-Arg竞争NOS，从而抑制NO的生成;因此，ADMA被确定为NOS主要的内源性抑制物［5］。体内ADMA主要由蛋白精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase 1，PRMT1)催化含精氨酸残基的蛋白质甲基化生成含ADMA残基的蛋白质，再经蛋白水解释放出游离的ADMA;除了少部分经肾脏排泄以外，内源性ADMA主要经二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)代谢消除［6-7］，已知DDAH现有2种亚型，即DDAH1和DDAH2，均在骨骼肌有表达;由此可见，PRMT1和DDAH是决定内源性ADMA浓度的关键因子。它们与ADMA构成的PRMT1-ADMA-DDAH通路共同调节体内NOS活性及NO的生成。

研究发现，长期耐力运动或短时间中低强度运动可增加骨骼肌NOS活性和NO含量，而长期高强度运动或一次性力竭运动则显降低骨骼肌NOS活性，减少NO含量［8-10］，但其调控机制尚不明确。有研究发现，无论是在静息状态下还是在运动时，给予外源性NOS抑制物N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)均可抑制腓肠肌中NO含量［11］。因此，亟待证明内源性 NOS抑制物ADMA及其信号通路PRMT1-ADMA-DDAH是否参与运动时骨骼肌组织NO生成的调节。本研究拟以耐力运动4周大鼠模型为实验对象，观察短期耐力运动对大鼠比目鱼肌收缩功能以及骨骼肌组织NOS表达和NO含量的影响，再进一步检测骨骼肌组织线粒体生物合成与功能以及PRMT1-ADMA-DDAH通路的变化，为阐明内源性NOS抑制物及其信号通路调控骨骼肌收缩功能与线粒体生物合成提供新的实验依据。

材料和方法

1 主要试剂

羊抗鼠DDAH1和DDAH2抗体购自Abcam;兔抗鼠PRMT1、nNOS、eNOS、iNOS和GAPDH抗体均购自 Santa Cruz;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、脂质过氧化产物丙二醛(malondialdehyde，MDA)和ATP含量检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;NO含量和NOS活性检测试剂盒均购自南京建成生物研究所;ECL发光试剂购自Cell Signaling Technology;过氧化物酶增殖体受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、核呼吸因子(nuclear respiratory factor-1，NRF)、GAPDH、细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ，COXⅠ)和β-actin引物由Invitrogen合成;RT-PCR试剂盒购于TaKa-Ra;其余试剂均为国产分析纯。

2 动物模型制备及分组

体重为180～200 g的SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由广东省医学实验动物中心提供［合格证号为SYXK(粤):2010-0104］。大鼠适应性喂养7 d后，随机分为2组:正常对照(control)组常规饲养，自由进食及饮水;运动(running)组除与正常对照组一样给予正常进食及饮水外，还按文献方法［12］制备跑步运动大鼠模型:第1周为跑步适应期，先以10 m/min的速度跑10 min，然后以每天2 m/ min速度递增，时间递增10 min，直到速度为20 m/mim、时间60 min的强度;从第2周起，大鼠每天先以15 m/min的速度跑15 min，再以20 m/min的速度跑60 min，最后以15 m/min的速度跑15 min，每周跑5 d，共跑4周。确保正常对照组和运动组大鼠的初始体重无显著性差别，并于每周对大鼠体重进行监测。

3 主要方法

3.1 骨骼肌收缩功能的测定 用10%水合氯醛麻醉大鼠(30 mg/kg，腹腔注射)，先经颈动脉插管收集血标本;再迅速分离骨骼肌，置于预冷及充氧(95% O2和5%CO2)的K-H缓冲液中;将肌条固定于充满K-H缓冲液的浴槽中，连接PowerLab八道电生理记录仪和Labchart7数据采集分析系统;肌条的单刺激、强直刺激收缩张力和疲劳收缩张力参照本实验室已建立的测定方法［13］，具体参数如下:在37℃恒温和充氧(95%O2和5%CO2)状态下，调节肌条于最适长度，平衡15 min后，给予10 V电压、100 ms波宽的单个脉冲电刺激肌条，记录肌条的单刺激收缩张力;换液并平衡15 min后，给予10 V电压、0.5 ms波宽、60 Hz频率的电刺激肌条2 s，记录强直收缩张力;再换液平衡15 min后进行疲劳测试，给予10 V电压，0.5 ms波宽，60 Hz频率的电刺激，每间隔1 s刺激1次，共持续100 s，每隔20 s记录疲劳收缩张力。

3.2 骨骼肌ATP含量的测定 采用荧光素酶法，严格按照碧云天生物技术研究所提供的ATP检测试剂盒说明书步骤测定骨骼肌中ATP含量，通过多功能酶标仪读取相对光单位值(relative light unit，RLU)，用标准品以相同方法做出标准曲线后，计算出各组大鼠骨骼肌中的ATP含量。

3.3 骨骼肌线粒体生物合成的测定 以线粒体DNA含量来反映线粒体生物合成情况，前者又可用线粒体基因COXⅠ与核基因β-actin的拷贝数比值来表示。提取骨骼肌的总DNA，取100 ng基因组DNA为模板以 COXⅠ和 β-actin引物(表1)进行PCR反应;PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下拍照后进行灰度扫描，以COXⅠ与β-actin mRNA的相对灰度值反映线粒体生物合成情况。

3.4 线粒体生物合成调控因子的转录水平变化

采用TRIzol提取骨骼肌中总RNA，通过RT-PCR检测线粒体生物合成的关键调节因子PGC-1α及其下游因子NRF转录情况;PGC-1α和NRF引物见表1。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下拍照后进行灰度扫描，并以目的基因与GAPDH mRNA的灰度比值反映基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.5 骨骼肌NOS活性、NO水平及SOD活性、MDA含量的测定 骨骼肌中NOS活性及NO含量用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定，其中NO含量测定采用硝酸还原酶法;骨骼肌中SOD活性和MDA含量按照碧云天生物有限公司试剂盒说明书进行操作。

3.6 骨骼肌NOS蛋白和PRMT1/DDAH蛋白表达的检测 采用Western blot法检测骨骼肌中NOS和PRMT1/DDAH通路蛋白表达情况。取30 mg大鼠比目鱼肌剪碎，加入RIPA裂解液制备10%组织匀浆液;在4℃下离心10 min(12 000 r/min)，定量后每个样本取30 μg蛋白，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，电转至PVDF膜上，脱脂奶粉室温封闭1 h，I抗4℃摇晃过夜，加辣根过氧化酶标记的II抗室温孵育2 h，最后进行ECL化学发光法显色，用凝胶成像系统(ChemiDocTMXRS+System，Bio-Rad)扫描后进行图像数据分析。

3.7 血清ADMA含量的测定 大鼠血清中ADMA含量采用高效液相色谱法测定。取1 mL血清加入20 mg 5-磺基水杨酸混匀，冰上静置10 min，于4℃下离心10 min(2 000×g)，取10 μL上清与100 μL O-邻苯二醛反应液混匀，室温放置3 min，进样进行荧光检测，激发波长为338 nm，发射波长为425 nm。通过比较样品和标准品的峰下面积计算出样本ADMA含量。

4 统计学处理

实验数据采用SPSS 12.0统计软件处理，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异用t检验进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 耐力运动4周对大鼠骨骼肌收缩功能的影响

实验结束时正常对照组和运动组大鼠体重无显著差别;同时，从2组分离出来的比目鱼肌的净重以及最适初长度也无显著差异。但与正常对照组比较，耐力运动4周显著提高大鼠比目鱼肌的单次收缩和强直收缩张力;同时还在疲劳刺激的60 s、80 s和100 s各时点明显增加比目鱼肌的疲劳收缩张力，提示4周耐力运动增强大鼠比目鱼肌的收缩功能和耐疲劳能力，见图1。

Figure 1.The effects of running on the contraction of rat skeletal muscles.A:the twitch tension and tetanic tension;B:the fatigue test of rat soleus muscle.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图1 运动对大鼠骨骼肌收缩功能的影响

2 耐力运动4周对大鼠骨骼肌内线粒体功能和线粒体生物合成的影响

结果如图2所示，运动组大鼠比目鱼肌内ATP含量均明显高于正常对照组(P＜0.01)，同时运动4周明显增加大鼠比目鱼肌中线粒体基因COX I与核基因β-actin的拷贝数比值。

Figure 2.The effects of running on ATP content，mitochondrial biogenesis and its regulation in rat skeletal muscles.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control.图2 运动对大鼠骨骼肌ATP含量、线粒体生物合成及线粒体功能调控的影响

调控线粒体生物合成和线粒体功能的重要转录辅助因子PGC-1α，可通过与靶基因启动子区域结合并募集NRF等转录因子，调节线粒体生物合成;结果显示运动组大鼠比目鱼肌中PGC-1α和NRF转录水平均显著高于正常对照组。以上这些结果提示，运动4周增加正常大鼠比目鱼肌的线粒体生物合成和线粒体功能。

3 耐力运动4周对大鼠骨骼肌NOS活性、蛋白表达及NO含量的影响

与正常对照组比较，4周耐力运动明显增加大鼠比目鱼肌中nNOS和eNOS蛋白的表达(P＜0.05)，一定程度增加iNOS蛋白的表达，但差异无统计学意义;此外，4周耐力运动大鼠骨骼肌组织NOS活性显著增强(P＜0.01)。然而，骨骼肌组织NO水平的相对增加幅度较NOS的表达及活性小，见图3。

4 耐力运动4周对大鼠血清ADMA水平和骨骼肌PRMT1、DDAH蛋白表达的影响

与正常对照组相比，耐力运动4周对大鼠比目鱼肌中内源性NOS抑制物ADMA的代谢酶DDAH2的蛋白表达降低，但另一亚型代谢酶DDAH1和内源性ADMA生成酶PRMT1的蛋白表达变化不明显，致使运动4周大鼠血清内源性ADMA浓度比正常对照组有所升高，见图4。

Figure 3.The effects of running on the expression and activity of NOS and NO content in rat skeletal muscles.A:the protein expression of NOS subunits;B:NOS activity;C:NO content in the rat soleus.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图3 运动对大鼠骨骼肌NOS活性和NO含量的影响

Figure 4.The effects of running on serum ADMA content and protein expressions of PRMT1，DDAH in rat skeletal muscles.A:the serum ADMA content;B:protein expression of PRMT1，DDAH1 and DDAH2 in rat soleus.Mean±SD.n=5.图4 运动对大鼠血清ADMA含量及骨骼肌PRMT1、DDAH蛋白的影响

5 耐力运动4周对大鼠骨骼肌氧化应激的影响

本研究通过检测骨骼肌SOD活性及脂质过氧化产物MDA含量来反映氧化应激状态。结果如图5所示，与正常对照组比较，运动组大鼠骨骼肌中SOD活性显著升高，而MDA含量明显降低，提示4周耐力运动可降低大鼠骨骼肌组织中的氧化应激水平。

讨论

适当的运动有助于增强骨骼肌的收缩能力，但过度的运动却降低骨骼肌的收缩能力，引起骨骼肌损伤;线粒体作为细胞的主要供能场所，其功能与骨骼肌的收缩能力密切相关［14］。本研究发现，4周耐力运动明显增加骨骼肌的收缩功能和抗疲劳能力，推测可能是由于短期的耐力运动增加了骨骼肌线粒体功能和线粒体生物合成所致。本研究进一步检测发现，运动大鼠骨骼肌组织ATP含量和线粒体DNA含量增加;不仅如此，本研究还发现，4周耐力运动上调促进线粒体生物合成的关键调节因子PGC-1α及其下游NRF的基因转录。上述结果均提示短期耐力运动增加线粒体生物合成和线粒体功能，但短期耐力运动上调线粒体生物合成的机制并不完全清楚。

越来越多的研究表明，NO对骨骼肌细胞能量代谢和线粒体生物合成调节有着双重调节作用［15］。Nisoli等［16］认为NO对心肌线粒体的作用具有浓度依赖性，高浓度的NO可抑制线粒体呼吸，而低浓度NO有利于提高线粒体呼吸功能和氧化代谢能力。最近本实验室研究还发现，限食8周可低幅度增加NO水平，明显增加正常大鼠骨骼肌的收缩功能和线粒体生物合成［17］。一方面，NO可通过sGC-cGMP依赖途径，激活线粒体生物合成的关键转录因子PGC-1α，增加线粒体生物合成;另一方面，NO又可与超氧阴离子反应，产生强大的超氧亚硝酸阴离子(ONOO-)，氧化抑制呼吸链的酶活性，诱发或加重氧化应激［18-19］。研究表明，剧烈运动迅速升高NO水平，导致骨骼肌大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生;相反，慢性适度运动缓慢增加NO水平，且维持在低浓度水平，低水平的NO减少与超阳阴离子的反应，抗氧化酶活性增强，ROS增加不明显［20］。本研究结果表明，4周耐力运动低幅度增加NO水平，增加ATP含量和线粒体生物合成及其调节因子PGC-1α和NRF的转录，使骨骼肌收缩功能和耐疲劳能力增强;同时，4周耐力运动明显增加骨骼肌抗氧化酶SOD的活性，并降低脂质过氧化产物MDA的含量，提示短期耐力运动降低骨骼肌组织氧化应激。

Figure 5.The effects of running on SOD activity(A)and MDA content(B)in rat skeletal muscles.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.图5 运动对大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量的影响

短期耐力运动增加大鼠骨骼肌组织NO含量，主要是由于上调NOS的表达及活性，增加NO的生成;本研究的实验结果提供了有力的证据，4周耐力运动明显增加大鼠比目鱼肌中nNOS和eNOS的蛋白表达。大多认为运动增加NOS活性和蛋白表达的主要机制可能与切应力的调节有关;有文献报道，运动增加心输出量，导致血流在各器官重新分配，骨骼肌内血流量增加，导致肌肉内血管剪切力增大，促进血管内皮细胞NOS mRNA的表达，使NOS活性增强，进而增加NO的生成，提高运动能力［21］。然而4周耐力运动仅增加eNOS和nNOS的蛋白表达，可能与NOS同工酶的分布有一定关系;有研究表明，人和啮齿类动物骨骼肌主要表达nNOS和eNOS，其中nNOS分布在肌纤维膜上，而eNOS分布在线粒体附近;由于eNOS分布的特殊性，eNOS-/-突变小鼠骨骼肌中线粒体酶的活力和氧化磷酸化水平降低，PCG-1α基因转录下调，线粒体密度和DNA水平下降［22］。

机体还存在一种调节NO生成的内源性机制，ADMA作为NOS的内源性抑制物，可减少NO的生成;我室和国内外学者大量研究表明，内源性ADMA升高是心血管疾病和糖尿病心血管并发症的共同危险因子。内源性ADMA的浓度主要是被PRMT1和DDAH共同调节的［6-7］;因此，本研究检测了大鼠血清ADMA浓度和骨骼肌中 PRMT1、DDAH1和DDAH2的蛋白表达，结果发现运动4周大鼠血清ADMA浓度比对照组大鼠略有升高;而运动大鼠骨骼肌组织DDAH2蛋白表达的明显下调。这些结果虽无统计学上的显著性，但结合NOS蛋白和活性大幅度增加，而NO水平增加幅度相对较小，暗示4周耐力运动大鼠的骨骼肌已开始启动对NO水平增加的负反馈调节，ADMA作为内源性NOS抑制物可能在防止骨骼肌运动损伤中起重要作用。然而，长期高强度运动或一次性力竭运动明显降低骨骼肌内NOS活性、减少 NO含量，是否与 PRMT1-ADMDDAH通路的相应变化有关，还有待进一步研究证明。

总之，本研究发现4周耐力运动提高骨骼肌NO水平，促进线粒体生物合成，增强正常大鼠比目鱼肌的单次收缩、强直收缩以及疲劳收缩肌张力;而维持骨骼肌内NO水平的稳定有赖于NOS和ADMA之间的平衡调控。这些结果将为阐明短期耐力运动增强正常大鼠比目鱼肌收缩功能提供新的实验数据。

［1］ Hirst DG，Robson T.Nitric oxide physiology and patholo-gy［J］.Methods Mol Biol，2011，704:1-13.

［2］ Eghbalzadeh K，Brixius K，Bloch W，et al.Skeletal muscle nitric oxide(NO)synthases and NO-signaling in"diabesity"——what about the relevance of exercise training interventions?［J］.Nitric Oxide，2014，37:28-40.

［3］ Tengan CH，Rodrigues GS，Godinho RO.Nitric oxide in skeletal muscle:role on mitochondrial biogenesis and function［J］.Int J Mol Sci，2012，13(12):17160-17184.

［4］ Stamler JS，Meissner G.Physiology of nitric oxide in skeletal muscle［J］.Physiol Rev，2001，81(1):209-237.

［5］ Vallance P，Leone A，Calver A，et al.Endogenous dimethylarginine as an inhibitor of nitric oxide synthesis［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1992，20(Suppl 12):S60-S62.

［6］ Boisvert FM，Cote J，Boulanger MC，et al.A proteomic analysis of arginine methylated protein complexes［J］.Mol Cell Proteomics，2003，2(12):1319-1330.

［7］ MacAllister RJ，Parry H，Kimoto M，et al.Regulation of nitric oxide synthesis by dimethylarginine dimethylaminohydrolase［J］.Br J Pharmacol，1996，119(8):1533-1540.

［8］ McConell GK，Bradley SJ，Stephens TJ，et al.Skeletal muscle nNOS mu protein content is increased by exercise training in humans［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，93(2):R821-R828.

［9］ Cocks M，Shaw CS，Shepherd SO，et al.Sprint interval and endurance training are equally effective in increasing muscle microvascular density and eNOS content in sedentary males［J］.J Physiol，2013，591(Pt 3):641-656.

［10］ Song W，Kwak HB，Kim JH，et al.Exercise training modulates the nitric oxide synthase profile in skeletal muscle from old rats［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2009，64(5):540-549.

［11］车力龙，欧阳驰，肖德生.长期耐力运动对大鼠腓肠肌的损伤及一氧化氮的调节作用［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(42):8294-8298.

［12］Dolinsky VW，Jones KE，Sidhu RS，et al.Improvements in skeletal muscle strength and cardiac function induced by resveratrol during exercise training contribute to enhanced exercise performance in rats［J］.J Physiol，2012，590 (Pt 11):2783-2799.

［13］El-Khoury R，Bradford A，O'Halloran KD.Chronic hypobaric hypoxia increases isolated rat fast-twitch and slowtwitch limb muscle force and fatigue［J］.Physiol Res，2012，61(2):195-201.

［14］Yan Z，Lira VA，Greene NP.Exercise training-induced regulation of mitochondrial quality［J］.Exerc Sport Sci Rev，2012，40(3):159-164.

［15］Tengan CH，Rodrigues GS，Godinho RO.Nitric oxide in skeletal muscle:role on mitochondrial biogenesis and function［J］.Int J Mol Sci，2012，13(12):17160-17184.

［16］Nisoli E，Cozzi V，Carruba MO.Amino acids and mitochondrial biogenesis［J］.Am J Cardiol，2008，101(11A): 22E-25E.

［17］邱 霓，李 聪，方伟进，等.限食8周对大鼠不同类型骨骼肌收缩功能及线粒体生物合成的影响［J］.中国病理生理杂志，2015，31(2):193-200.

［18］Lira VA，Brown DL，Lira AK，et al.Nitric oxide and AMPK cooperatively regulate PGC-1 in skeletal muscle cells［J］.J Physiol，2010，588(Pt 18):3551-3566.

［19］Powers SK，Talbert EE，Adhihetty PJ.Reactive oxygen and nitrogen species as intracellular signals in skeletal muscle［J］.J Physiol，2011，589(Pt9):2129-2138.

［20］Sahlin K，Shabalina IG，Mattsson CM，et al.Ultraendurance exercise increases the production of reactive oxygen species in isolated mitochondria from human skeletal muscle［J］.J Appl Physiol，2010，108(4):780-787.

［21］Whyte JJ，Laughlin MH.The effects of acute and chronic exercise on the vasculature［J］.Acta Physiol(Oxf)，2010，99(4):441-450.

［22］Momken I，Fortin D，Serrurier B，et al.Endothelial nitric oxide synthase(NOS)deficiency affects energy metabolism pattern in murine oxidative skeletal muscle［J］.Biochem J，2002，368(Pt 1):341-347.

(责任编辑:陈妙玲，余小慧)

Endogenous nitric oxide synthase inhibitor increase skeletal muscle contractility and mitochondria biosynthesis in 4-week running rats

QIU Ni，FANG Wei-jin，LI Cong，LI Xiao-mei，XIONG Yan

(Guangzhou Institute of Snake Venom Research，School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，China.E-mail:xiongyan2001@yahoo.com)

AIM:To observe the effect of endogenous nitric oxide synthase(NOS)inhibitor asymmetric dimethylarginine(ADMA)and its signaling pathways on NO levels and skeletal muscle contractility in 4-week running rats.METHODS:The 4 weeks running rat model was established.The twitch tension，tetanic tension and the fatigue test of soleus muscle induced by electrical stimulation ex vivo were detected.The ATP content，mitochondrial DNA levels and the mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α(PGC-1α)，nuclear respiratory factor(NRF) were measured to reflect the mitochondrial function and biosynthesis in the skeletal muscle.Serum ADMA concentration was detected by high performance liquid chromatography.The endogenous ADMA enzymes PRMT1 and 2 subtypes of ADMA metabolism enzyme DDAH，3 subtypes of NOS protein expression in the skeletal muscle were determined by Western blot.NOS activity and nitric oxide(NO)content were analyzed by colorimetric method.RESULTS:Compared with normal control group，the twitch tension，tetanic tension and the anti-fatigue capability of soleus muscle in running group were significantly enhanced，ATP content，mitochondrial DNA content and the mRNA expression of PGC-1α and NRF were significantly increased(P＜0.01).In addition，the protein expression of constitute type NOS(cNOS)and NOS activity were significantly increased(P＜0.01)，but the increase in NO content was relatively smaller in soleus muscle in exercise group(P＜0.05).Moreover，serum ADMA concentration in running group was increased，while the DDAH2 expression in skeletal muscle was decreased.CONCLUSION:Short-term endurance exercise enhances the twitch tension，tetanic tension and fatigue resist-ance of soleus muscle.The mechanism may be that increased cNOS expression feedbacks to increase ADMA concentration，thus maintaining the increase in NO synthesis at a relatively low level，and resulting in promoting skeletal muscle mitochondria biosynthesis and mitochondrial function.

Endurance exercise;Skeletal muscle;Contractile function;Nitric oxide;Mitochondria biogenesis

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.017

1000-4718(2016)07-1259-07

2015-12-18

2016-05-11

国家自然科学基金资助项目(No.81170778);广东省科技计划资助项目(No.20138021800098);广州市科技计划资助项目(No.2014J4100067)

△Tel:020-37103273;E-mail:xiongyan2001@yahoo.com