猪伪狂犬病毒感染病例的荧光定量PCR检测

贺志昊，马惠琴，龙冬梅，王芸华，杨廷军，张　平（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州　毕节　551700）

猪伪狂犬病毒感染病例的荧光定量PCR检测

贺志昊，马惠琴，龙冬梅，王芸华，杨廷军，张平
（贵州省毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节551700）

毕节某猪场出现妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况，为确诊病原，对流产胎儿的组织进行了实验室检测。流产胎儿的组织经猪伪狂犬病毒野毒株实时荧光PCR检测，结果显示，胎儿组织为猪伪狂犬病毒（PRV）阳性；根据临床症状及伪狂犬病毒野毒株实时荧光PCR检测确诊该猪场存在猪伪狂犬病毒野毒感染。

猪伪狂犬病毒；临床症状；实时荧光RT-PCR

猪伪狂犬病属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、猪疱疹病毒属，是由疱疹病毒I型引起的一种急性传染病。可导致怀孕母猪发生流产、死亡、产木乃伊胎及弱仔；新生仔猪发生大批急性死亡，伴有呕吐、腹泻及发抖，震颤和运动失调等神经症状［1，2］；免疫抑制猪只对其它疫病易感性增加，影响仔猪生长发育。猪发生经典伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异。成年猪一般呈隐性感染；对怀孕母猪可导致出现流产，产死胎、木乃伊胎和种猪不育等综合症候群；15日龄以内仔猪的发病死亡率可达100%；目前猪群伪狂犬野毒感染率仍呈不断上升趋势，临床发病症状有所缓和，亚临床感染较多，防控形势依然十分严峻［3-5］。对毕节某规模猪场出现的妊娠母猪流产、产死胎及部分仔猪发病的情况，为确诊病原，本文利用实验室实时荧光RT-PCR诊断技术，最终确诊为猪伪狂犬病毒感染引起。

一、材料与方法

（一）材料

1.病料。采集流产胎儿组织放在50%甘油生理盐水溶液中，低温冷藏保存运至毕节市动物疫病预防控制中心兽医实验室。

2.主要试剂。世纪元亨猪伪狂犬病毒提取试剂盒，猪伪狂犬病毒通用型荧光定量PCR试剂盒

（二）方法

1.样品的处理：取流产胎儿组织，用手术剪剪碎混匀后取0.5g于组织匀浆机中研磨，加入2mL去离子水，研磨均匀后离心取500μL上清液于灭菌离心管中。

2.DNA提取：按照猪伪狂犬病毒提取试剂盒说明书进行。

3.实时荧光RP-PCR检测

反应采用25μL体系，反应体系为：无菌无核酸水2.7μL，RT-PCR反应液10μL，酶混合液0.4μL，荧光探针1.9μL，DNA模板10μL。反应条件为：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步收集FAM荧光信号，共40循环（报告基因“FAM”，淬灭基团“NONE”）

二、试验结果

（一）临床症状

仔猪：仔猪高热41℃以上、食欲废绝、呼吸困难、流涎、腹泻等症状，继而表现神经症状，被毛震颤，继肌肉痉挛、间歇性抽搐、共济失调、四肢呈划水状（见图1），后期麻痹、卧地不起以至昏迷死亡。怀孕母猪：出现流产、死胎、木乃伊胎和不育综合症候群，其中以产死胎为主。有轻微的咳嗽，渴欲增加，体温略有升高。

图1　病猪呈现抽搐，四肢呈现划水状

（二）实时荧光RT-PCR试验结果

对流产胎儿组织总DNA进行实时荧光RT-PCR检测，结果显示，组织样品为阳性（见图2）。

图2　PRV实时荧光RT-PCR检测结果A1：阳性对照；B1：阴性对照；C1/D1/H1：待检样品

由图2可知流产胎儿组织样品DNA均呈出现特异性扩及增曲线。现

三、讨论

目前疫苗免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施。该病目前尚无特效的治疗方法，主要通过血清免疫进行治疗。据报道对1月龄以内的仔猪，在感染后12 h腹腔注射抗病血清有治疗效果。对体重约20 kg的猪用30 m L含500个中和单位的抗血清治疗效果较好，可降低死亡率［6-8］。在病猪未出现神经症状之前，注射抗伪狂犬病高免血清或病愈猪的全血有一定疗效，如已出现神经症状则效果不明显。科学的疫苗免疫方案配合抗体检测验证免疫效果，采取严格的生物安全措施，消灭猪场的鼠类，坚持自繁自养，无害化处理对预防本病有重要意义。同时，还要严格控制犬、猫、鸟类和其他禽类进入猪场，严格控制人员来往，并做好消毒及定期监测等工作，如发现野毒感染血清学阳性猪应及时隔离或淘汰处理，以保持猪群无野毒感染和安全健康。

猪伪狂犬病一直是发病率、死亡率都很高的传染病，一旦发生会给养猪业带来很大损失，因此猪伪狂犬病的预防、诊断检测问题一直备受世界各国关注［9］。猪伪狂犬临床上多表为母猪的流产和仔猪的腹泻、神经症状，仅从临床表现和剖检很难将其与有相似症状的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等区分开来，需要进行实验室检测才能确诊。本文采用分子生物学技术对流产胎儿组织进行实时荧光RT-PCR方法的检测，确诊了该次疫病由猪伪狂犬病毒引起。为今后实验室确诊猪伪狂犬病提供基础科学依据。

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（编辑：刘国华）

S8-0

A

1673-9019（2016）12-0030-02

2016-03-30

贺志昊（1986-），男（满族），河北人，硕士，主要从事实验室检测诊断工作。