棉花粉蚧化学感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表达谱分析

赵　洁，程代凤，陆永跃

(华南农业大学昆虫学系，广东广州，510642)

Lartigue A, Campanacci V, Roussel A,et al. X-ray structure and ligand binding study of a moth chemosensory protein[J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(35): 32094-32098.



棉花粉蚧化学感受蛋白基因PsCSP10的克隆及表达谱分析

赵洁，程代凤，陆永跃*

(华南农业大学昆虫学系，广东广州，510642)

本研究克隆出了棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley化学感受蛋白(CSPs)基因PsCSP10的全长cDNA(GenBank登录号：KT958555)，其核苷酸序列长640 bp，编码128个氨基酸，预测其成熟蛋白分子量14.99 kD，等电点6.61，且含有4个保守的半胱氨酸，符合昆虫CSPs的典型特征。该基因编码的氨基酸序列和其他昆虫化学感受蛋白基因编码的氨基酸序列相似性为50%-56%。应用Real-time PCR测定的结果表明棉花粉蚧各发育阶段中PsCSP10均有表达，但在雄成虫中的相对表达量显著高于其他发育阶段。在分别用扶桑Hibiscusrosa-sinensisL.、棉花GossypiumhirsutumL.、马缨丹LantanacamaraL.饲养获得的雄成虫中PsCSP10相对表达量不存在差异。研究结果为进一步明确棉花粉蚧中PsCSP10的功能奠定了基础。

棉花粉蚧；化学感受蛋白基因；克隆；序列分析；表达谱

昆虫在长期进化过程中形成了一套高度精细、灵敏的化学信息感受系统，用以识别来自外界环境、种间、种内的化学信息物质，从而进一步调控其寄主定位、寻偶、躲避不利环境等行为(Craddock and Boake，1992；Shaveretal.，1998；Saverschek and Roces，2011)。气味结合蛋白(Odorant binding proteins，OBPs)及化学感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)在这种化学感受机制中起着重要作用。与气味结合蛋白主要结合挥发性的气味分子和性信息素分子不同，化学感受蛋主要结合和运载非挥发性气味分子(Steinbrechtetal.，1995)。CSPs广泛分布于几乎所有昆虫类群各种化学感受器中，且具有广泛的功能(刘金香等，2005；柳晓磊等，2011)，其分子进化保守性非常明显，同种昆虫或者不同目、科昆虫间化学感受蛋白同源性在30%-90%；化学感受蛋白相对分子量平均13 kD，多肽链有4个保守的半胱氨酸位点，形成两个二硫键，目前发现的昆虫化学感受蛋白均为单体，未发现翻译后修饰(Krieger and Breer，1999；Briandetal.，2002；Lartigueetal.，2002；Campanaccietal.，2003)。

棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley在巴基斯坦、印度等国暴发成灾(Muhammadetal., 2009)，2008年8月我国大陆在广东广州首次发现其入侵为害(武三安和张润志，2009)，成为了我国新的入侵害虫，且对我国园林、果蔬和多种大田作物等的安全生产存在潜在的严重威胁(陆永跃等，2008；马骏等，2009)。该虫寄主范围广，危害多种重要经济作物(孙峰等，2011；孙峰和陆永跃，2011；Huangetal.，2013；王飞飞等，2014)；繁殖能力强，年发生世代多，种群增长潜力大(陆永跃等，2008；Ghulametal.，2009；王超等，2014)，适应环境能力强(Nikametal.，2010；Wangetal.，2010；关鑫等，2011；陈芳和陆永跃，2014a)。目前关于棉花粉蚧的研究大多集中在生物学、生态学方面(王飞飞等，2014；关鑫和陆永跃，2012；Zhouetal.，2013)，关于该虫化学感受蛋白基因已鉴定出12个相关基因(PsolCSP1-PsolCSP12)，并进行了进化分析(赵洁和陆永跃，2015)，但对各个基因的表达模式、功能等还未见研究。本文在已有研究基础克隆得到了一个棉花粉蚧的化学感受蛋白基因PsCSP10，并对该虫不同发育阶段、不同寄主饲养获得的雄成虫中该基因的表达规律进行了研究，为进一步研究明确该基因的功能奠定基础。

1　材料与方法

1.1供试样品与试剂

供试棉花粉蚧为本实验室用新鲜扶桑叶饲养，饲养条件为：温度28℃±1℃、相对湿度70%±5%、光周期为(L∶D)16 h∶8 h。分别取卵、一龄若虫、二龄若虫、三龄若虫、雄成虫、雌成虫样品及其混合样品，经液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱中保存备用。棉花粉蚧转录组由北京诺和致源生物信息科技有限公司测定，转录组样本为各龄期混合样提取的RNA。Ttizol试剂、反转录试剂盒、载体pGM-T、DNA纯化回收试剂盒及SuperReal荧光定量预混试剂等均购自天根生化科技(北京)有限公司；所用引物自行设计并由生工生物科技有限公司(广州)合成，试剂盒、克隆感受态菌株DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司。

寄主植物扶桑Hibiscusrosa-sinensisL.、棉花GossypiumhirsutumL.、马缨丹LantanacamaraL.种植于实验室阳台上，常规管理，不使用任何药剂防治病虫害。将粉蚧饲养于寄主上，3代之后分别取雄成虫样品，经液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2棉花粉蚧不同发育阶段总RNA的提取及cDNA的合成

按照Trizol试剂使用说明书分别提取棉花粉蚧各发育阶段、各阶段混合样及不同寄主植物饲养获得的雄成虫的总RNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，经Nanodrop2000 Spectrophotometer(Thermo，USA)核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度。按照Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒的操作说明反转录合成第一链cDNA，并稀释2倍保存在-20 ℃冰箱备用，以此为荧光定量PCR模板。

1.3引物的设计与合成

根据测得的棉花粉蚧转录组，棉花粉蚧化学感受蛋白PsCSP10基因序列(GenBank登录号：KT958555)，利用NCBI中prime blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index. cgi?LINK_LOC=BlastHome)设计PsCSP10的3′RACE(CSP3′outer和CSP3′inner)和5′RACE(CSP5′outer和CSP5′inner)。用于real-time定量PCR反应的特异性引物(CSP10F和CSP10R)、内参基因为α-tubulin(GenBank登录号：KJ909508)(陈芳和陆永跃，2014b)。引物序列如下：

表1　用于PCR的引物序列

1.4RACE克隆PsCSP 10基因全长序列

根据RACE试剂盒操作步骤进行3′和5′RACE PCR扩增，以各发育阶段混合样RNA反转的第一链cDNA为模版。将3′和5′ RACE PCR产物经琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，克隆于pMD-T载体内，然后转化到大肠杆菌DH5α，挑取白色菌落，放入含有100 μg/L氨苄青霉素(Amp)的LB培养液震荡过夜，经菌液PCR鉴定后，送样测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。将获得的片段进行拼接获得PsCSP10的全长cDNA序列。

1.5定量PCR检测PsCSP10的时空表达

荧光定量PCR采用20 μL体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向引物、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模板1 μL，50× ROX Reference Dye Δ 0.4 μL，加水至20 μL，混匀，轻微离心，反应在Stratagene Mx3005P实时荧光定量PCR仪中进行，反应条件为：95 ℃预变性10 min；之后95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，进行40个循环；最后跟随一个生成溶解曲线的程序。检测过程中每个样品重复3次。

1.6定量PCR检测PsCSP10在不同寄主饲养下雄成虫中表达

荧光定量PCR采用20 μL体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正向引物、反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL，以1 μL扶桑、棉花、马缨丹饲养下雄成虫的cDNA为模板，50 × ROX Reference Dye 0.4 μL，加水至20 μL，混匀，轻微离心，反应在Stratagene Mx3005P实时荧光定量PCR仪中进行，反应条件为同1.5。

1.7分析方法

应用BLAST比对方法比较化学感受蛋白氨基酸序列的相似度(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；基于沙漠蝗化学感受蛋白CSP-sg4:A三维结构2gvs.1.A模板，利用在线网站swiss-model(http://www.swissmodel.expasy.org/)预测基因编码蛋白三维结构；利用2-△△Ct法相对定量的方法，以卵中表达量为标准，研究PsCSP10在棉花粉蚧卵、1龄若虫、2龄若虫、3龄若虫、雄成虫、雌成虫中的相对表达量及不同寄主饲养获得的雄虫中的相对表达量。

2　结果与分析

2.1棉花粉蚧PsCSP10基因克隆及序列分析

通过3′和5′RACE PCR克隆得到棉花粉蚧化学感受蛋白PsCSP10的全长基因，序列分析表明PsCSP10 cDNA全长为640 bp，包括94 bp的5′非翻译区，158 bp的3′非翻译区，以及387 bp的开放阅读框，编码128个氨基酸残基(包括N端29个氨基酸的信号肽)(图1)。成熟蛋白预测分子量为14.99 kD，等电点为6.61。利用BLAST对PsCSP10的同源蛋白进行搜索、对氨基酸序列的多重比对结果表明该基因编码的成熟肽中含有4个保守的半胱氨酸位点，具昆虫化学感受蛋白的典型特征。

通过BLAST比对发现棉花粉蚧PsCSP10与半翅目昆虫烟粉虱Bemisiatabaci(GenBank登录号：AEY84055.1)、绿盲蝽Apolyguslocorum(GenBank登录号：AGD80085.1)、褐飞虱Nilaparvatalugens(GenBank登录号：ACJ64054.1)化学感受蛋白氨基酸序列的相似度分别为50%、51%、52%；与鳞翅目昆虫棉铃虫Helicoverpaarmigera(GenBank登录号：AFR92095.1)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(GenBank登录号：AKT26484.1)、大螟Sesamiainferens(GenBank登录号：AGY49265.1)、小地老虎Agrotisipsilon(GenBank登录号：AGR39573.1)化学感受蛋白氨基酸序列的相似度分别为50%、52%、52%、52%；与双翅目昆虫致倦库蚊Culexquinquefasciatus(GenBank登录号：XP_001844696.1)、厩螫蝇Stomoxyscalcitrans(GenBank登录号：ADG96052.1)化学感受蛋白氨基酸序列的相似度分别为56%、53%；与鞘翅目昆虫稻水象甲Lissorhoptrusoryzophilus(GenBank登录号：AHE13802.1)、暗黑鳃金龟Holotrichiaparallela(GenBank登录号：AKI84394.1)化学感受蛋白氨基酸序列的相似度分别为55%、50%(表2、图2)。

图1　PsCSP10 cDNA及其推导的氨基酸序列Fig 1.　cDNA and predicted amino acid sequences of PsCSP10注：终止子以*号表示，下划线表示N端推导的信号肽。Note：The stop codon is indicated by an asterisk. Putative signal peptides at the N-termini are underlined

图2　PsCSP10和其他昆虫化学感受蛋白的全氨基酸序列比对Fig.2　Alignment of full amino acid sequences from PsCSP10 and chemosensory proteins of other insects

基因Gene昆虫种类SpeciesGenBank登录号GenBankaccessionno.蛋白名称Proteinname最高一致性(%)MaximalidentityE值Evalue致倦库蚊CulexquinquefasciatusXP_001844696.1CquiCSP564e-43烟粉虱BemisiatabaciAEY84055.1BtabCSP1506e-39棉铃虫HelicoverpaarmigeraAFR92095.1HarmCSP11509e-36稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusAHE13802.1LoryCSP6559e-36绿盲蝽ApolyguslucorumAGD80085.1AlucCSP5518e-36PsCSP10甜菜夜蛾SpodopteraexiguaAKT26484.1SexiCSP7534e-36暗黑鳃金龟HolotrichiaparallelaAKI84394.1HparCSP11503e-36大螟SesamiainferensAGY49265.1SinfCSP522e-36厩螫蝇StomoxyscalcitransADG96052.1ScalCSP534e-36褐飞虱NilaparvatalugensACJ64054.1NlugCSP8525e-36小地老虎AgrotisipsilonAGR39573.1AipsCSP3521e-38

2.2PsCSP10蛋白三维结构预测

应用Swiss-model预测得到了PsCSP10编码蛋白三维结构，表明其三维结构与其他昆虫的PsCSP编码蛋白一样主要形成α-螺旋(图3)。

图3　预测的PsCSP10编码蛋白的三维结构Fig.3　The predicted three-dimensional structure of PsCSP10

2.3PsCSP10基因的表达特征

各个虫期中PsCSP10均有表达，在雄成虫中的相对表达量显著高于其他发育阶段(ANOVA，F=37.430，df=17，P= 0.000；图4)。而在扶桑、棉花、马缨丹3种植物上分别饲养3代之后的雄成虫中PsCSP10的表达量无显著差异(ANOVA，F=0.472，df=8，P=0.645；图5)。

图4　棉花粉蚧不同发育阶段PsCSP10的相对表达水平Fig.4　Relative mRNA expression levels of the PsCSP10 in different development stages

图5　不同寄主饲养的棉花粉蚧雄成虫中PsCSP10的相对表达水平Fig.5　Relative mRNA expression levels of the PsCSP10 in male adults feed on different host plants

3　讨论

本研究应用real time-PCR和RACE技术克隆了编码棉花粉蚧化学感受蛋白PsCSP10的cDNA全长序列，经BLASTX分析结果显示该基因编码的氨基酸序列与其他半翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多种昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列一致性均在50%-56%，可见在以上多个类群昆虫中化学感受蛋白结构相对保守。PsCSP10与其他昆虫化学感受蛋白氨基酸序列中有19个氨基酸完全保守，推测这些氨基酸残基对维持化学感受蛋白的功能可能起着重要的作用，反映了昆虫在长期进化过程中对大量不同类型的环境化学因子刺激的适应和进化(刘金香等，2005；柳晓磊等，2011)。

昆虫化学感受蛋白二级拓扑结构主要由α-螺旋构成(Picimbonetal.，2000；Lartigueetal.，2002；Briandetal.，2002；刘金香等，2005)。本研究预测了PsCSP10编码蛋白空间结构，其建模模板为沙漠蝗跗节化学感受蛋白CSP-sg4。其分子内4个保守的半胱氨酸两两相连构成两个二硫键，是典型的α-螺旋，整个分子呈球形状(Piconeetal.，2001)。PsCSP10编码的蛋白三维结构与其他化学感受蛋白一样都主要是α-螺旋。可见二硫键和α-螺旋在昆虫化学感受蛋白中是相当普遍和保守的。

目前发现CSPs广泛存在于各种昆虫中，且在触角、喙、性腺、下唇须、跗节、复眼等多个组织部位中都有广泛的表达(Maleszka and Stange，1997；Angelietal.，1999；Nagan-Leetal.，2000；Jacquin-Jolyetal.，2001；Gongetal.，2007)。CSPs不仅可以溶解运输不容化学感受器亲脂性配体，同时还可调节昆虫生长发育、生理节律，参与体内免疫、信号传导等多项生理功能(Mcdonaid and Rosbash，2001；Lartigueetal.，2002；Montefortietal.，2002；Sandozetal.，2003；Wanneretal.，2004；Ozakietal.，2005；徐浩智等，2015)。多种昆虫中CSPs表达规律研究已完成，可根据CSPs表达情况初步推测CSPs所行使的功能。本研究表明棉花粉蚧不同发育阶段PsCSP10均能表达，尤以雄成虫中表达量最大，而扶桑、棉花、马缨丹等不同寄主上雄成虫中PsCSP10表达量无差异。棉花粉蚧雄成虫存活期较短，仅为2-4 d，在与雌成虫交配后1-2 d便死亡；雄性棉花粉蚧在交配过程起着主导作用，通过飞行、爬动寻找雌性成虫交配(朱艺勇等，2011)。因此，推测PsCSP10与识别寄主挥发物质可能无关，而可能与雄虫接受雌虫化学信息、调节生长发育或者其他生理过程等有关。

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Molecular cloning and expression analysis of chemosensory protein genePsCSP10 inPhenacoccussolenopsisTinsley (Hemiptera: Pseudococcidae)

ZHAO Jie, CHENG Dai-Feng, LU Yong-Yue

(Department of Entomology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, one CSP gene in cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley was cloned and characterized, and was namedPsCSP10 (GenBank accession no.: KT958555). ThePsCSP10 cDNA was 640 bp in length, encoding 128 amino acid residues with the predicated molecular mass of approximately 14.99 kD and pI of 6.61, of which four conservative cysteines were included. The alignment ofPsCSP10 showed moderate similarity (50%-56%) with the CSP genes of other insects analyzed with the deduced amino acid sequences.By Real-time PCR analysis, PsCSP10 was revealed to express across various development stages, and the expression level was more in the male adult. The expression ofPsCSP10 in the mealybug male adults fed on Chinese rose (Hibiscusrosa-sinensisL.), cotton (GossypiumhirsutumL.) and common lantana (LantanacamaraL.),respectively, had not significant difference. The results became the basis for further research onPsCSP10 gene functions inP.solenopsis.

PhenacoccussolenopsisTinsley; chemosensory protein gene; molecular cloning; sequence analysis; expression profile

广东省自然科学基金(S2013010013526);广东省研究生教育创新计划(2013JDXM14)

赵洁,女，1990年生，山西人，硕士研究生，研究方向为昆虫分子生态学，E-mail: zhaojie129scau@163.com

Author for correspondence, E-mail: luyongyue@scau.edu.cn

2016-05-13；接受日期Accepted：2016-06-30

Q963; S433

A

1674-0858(2016)04-0728-08