Carba NP法快速检测鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶的研究*

荆泳玮,胡访溪,阎　琦,夏梦琪,王东月,刘　新

(沈阳医学院，沈阳 110034)



·论著·

Carba NP法快速检测鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶的研究*

荆泳玮,胡访溪,阎琦,夏梦琪,王东月,刘新△

(沈阳医学院，沈阳 110034)

目的了解泛耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶表型及酶基因型，为临床合理使用抗生素，监控医院感染提供依据。方法收集117株鲍曼不动杆菌临床分离株进行常规微生物学检测，K-B纸片法筛选多重耐药鲍曼不动杆菌，通过Carba NP试验及改良Hodge试验进行产碳青霉烯酶表型检测，利用PCR对多重耐药不动杆菌耐药基因型进行确证。结果临床分离的117株鲍曼不动杆菌株有64株属多重耐药鲍曼不动杆菌，其中33株碳青霉烯酶阳性，检出碳青霉烯酶OXA-23耐药基因型，未检出IMP、VIM、NDM-1耐药基因。结论Carba NP法可以快速检测产碳青霉烯酶菌株，且敏感性强，操作简单，有助于提高产碳青霉烯酶菌株检出率，利于监控医院感染。

鲍曼不动杆菌；耐药基因；碳青霉烯酶

鲍曼不动杆菌为广泛存在于自然界的非发酵机会致病菌之一，可定植于医院环境及人体皮肤表面，自然环境中水和土壤等处大量存在。主要引起呼吸道、泌尿道、伤口等处感染[1]。据2015 年12月全国细菌耐药监测网(CARSS)根据1 427所医院数据报告：2014年10月至2015年9月鲍曼不动杆菌共分离183 178 株(10.7%)，位居分离的革兰阴性菌第4位，某些医院不动杆菌引起的医院感染数量已超过铜绿假单胞菌，日益增高的鲍曼不动杆菌检出率提示鲍曼不动杆菌已成为医院感染中的常见机会致病菌，使临床抗感染治疗及控制医院感染面临严峻挑战。鲍曼不动杆菌具有较强耐药性，特别是因产碳青霉烯酶导致的耐药，使临床抗感染困难重重，因此监控鲍曼不动杆菌及快速检测不动杆菌并鉴定其耐药性成为医院感染控制的重要任务。目前检测的方法主要是改良的Hodge试验及商品化Etest试条等，但这些方法操作步骤多，耗时长且材料昂贵，因此临床迫切需要简单、快速的检测方法用于鉴定产碳青霉烯酶的菌株。Carba NP法由Patrice Nordmann 于2012年首次报告[2]，此后该方法陆续优化和拓展用于检测碳青霉烯酶[3]，但目前用于流行病学尚未在临床推广应用。2015年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)药敏试验标准(M100-S25)引入了Carba NP试验[4]，提示临床微生物实验室、医院感染控制室、疾病控制等相关机构将广泛应用Carba NP试验方法。本研究根据目前多重耐药鲍曼不动杆菌流行情况，选择亚胺培南、酚红等试剂，通过Carba NP法对鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶检测，并经过改良Hodge实验及分子生物学技术确证并分析耐药基因型，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1菌株来源收集沈阳医学院附属医院2013～2015年临床分离鲍曼不动杆菌117株，分别来自呼吸科、ICU、消化外科、急诊室等科室。

1.2主要试剂与仪器氨苄西林、头孢他啶、头孢唑啉、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片均购自Oxoid公司；Carba NP 检测法试剂按文献[2]配制：0.5%酚红溶液，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，ZnSO4·7H2O亚胺培南/培他司丁(Merck & Dohme Corp.U.S.A.)，0.1 mol/L NaOH。ATB试剂(REF 32100，批号1003844720)。A液：2 mL 0.5%酚红溶液加入16.6 mL临床实验室试剂用水中，加入180 μL 0.1 mmol/L ZnSO4水溶液，0.1 mol/L NaOH及10%HCl调pH 为7.8±0.1。B液：每毫升A液中含有终浓度为6 mg/mL的亚胺培南/西司他丁。细菌DNA提取试剂盒、Taq酶，Marker DL2000，TAE缓冲液，琼脂糖均购自大连宝生物公司。PCR扩增仪为Eppendof公司产品，电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，质粒提取试剂盒由康为世纪公司提供。

1.3菌株筛查将临床标本首先进行涂片、革兰染色、显微镜观察：选择成对排列，且较难脱色的球杆菌标本，分区划线接种于中国蓝培养基中，44 ℃培养过夜，挑取单个无色的可疑菌落再次革兰染色镜检，符合之前的检测，进一步氧化酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验，初步确定为不动杆菌后通过ATB生化鉴定，经鉴定为鲍曼不动杆菌的菌株117株保存备用。

1.4多重耐药鲍曼不动杆菌检测采用K-B法检测鲍曼不动杆菌药物敏感性：接种环挑取纯培养的鲍曼不动杆菌菌苔，配制为0.5麦氏浓度菌悬液，涂布于整个M-H平板，通过纸片分散器将药敏纸片均匀贴于平板上，37 ℃温箱孵育18～24 h。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。按CLSI 2015标准选择多重耐药鲍曼不动杆菌菌株标记备用。

1.5不动杆菌碳青霉烯酶表型筛查

1.5.1Carba NP法快速检测碳青霉烯酶96孔细胞培养板，每一菌株做3个复孔，每孔加样量如表1，置于37 ℃温箱30 min后，观察各孔颜色变化[5]。

表1　Carba NP法快速检测碳青霉烯酶

注：若A液颜色为红色或橙红色，B液颜色为红色或橙红色即为Carba NP试验阴性；若A液颜色为红色或橙红色，B液为深黄色，黄色或浅橙色提示Carba NP试验阳性；如果A液颜色为红色、橙红色以外颜色，B液为橙色提示结果无效;-为该项无数据。

1.5.2改良Hodge试验进行碳青霉烯酶表型确证用无菌生理盐水将过夜培养的大肠埃希菌ATCC 25922调制成0.5麦氏菌悬液，然后进行1︰10稀释备用，将稀释的菌液均匀涂布于M-H平板，静置3～10 min，将10 μg的亚胺培南纸片贴于M-H平板中央，1 μL接种环挑取3～5个过夜培养的待测鲍曼不动杆菌菌落分别接种于平板上，接种时从纸片边缘向平板边缘划线，长度至少20～25 mm，于37 ℃温箱培养18～24 h后，观察结果。若在被测菌株与大肠埃希菌AT25922抑菌环交汇处，大肠埃希菌生长增强即可判定为产碳青霉烯酶菌株[6]。

1.5.3耐药基因型确证受试菌株的基因组及质粒分别通过试剂盒提取，按参考文献[7]合成引物(表2)。扩增基因主要为B类碳青霉烯酶中IMP、VIM、NDM-1，以及D类碳青霉烯酶中OXA-23、OXA-24等基因。PCR反应总体积为50 μL，其中Taq酶0.25 μL，引物1与引物2各1 μL，PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，无菌双蒸水定容至50 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环，最后72 ℃再延伸7 min。配置1%琼脂糖凝胶，将扩增产物于琼脂糖凝胶中100 v电泳30 min，在紫外凝胶成像仪下观察拍照。

2　结　果

2.1临床分离的不动杆菌初步微生物学鉴定标本涂片、染色、镜检为革兰阴性球杆菌，较难脱色，多成对排列；氧化酶阴性，动力阴性，硝酸还原实验阴性，触酶试验阳性。经ATB生化鉴定为不动杆菌。

2.2多重耐药不动杆菌筛选(K-B法)临床收集的117株不动杆菌中，多重耐药菌株64株，多重耐药率达51.2%(图1)。

表2　扩增耐药基因及测序引物

2.3不动杆菌碳青霉烯酶检测按CLSI(M100-S25)引入的Carba NP试验方法比对试验孔颜色变化，本研究中64株多重耐药不动杆菌中33株 Carba NP试验阳性，阳性率达55%。

图1　鲍曼不动杆菌药敏试验(K-B法)

注：M为Marker；s1～s3均为鲍曼不动杆菌。

图2部分菌株OXA-23基因PCR电泳图

2.4改良Hodge试验进行碳青霉烯酶表型确证64株多重耐药不动杆菌中33株提示改良Hodge阳性，阳性率达55%，Carba NP法检测碳青霉烯酶阳性率与改良Hodge法检测结果一致。

2.5PCR扩增耐药基因结果64株多重耐药菌中，33株检出OXA-23、OXA-24等酶基因，未检测到IMP、VIM、NDM-1基因(图2)，验证了Carba NP试验结果的准确性、一致性。

3　讨　论

近年来，鲍曼不动杆菌分离率呈上升趋势[8]，随着广谱抗生素的广泛使用，鲍曼不动杆菌对抗生素的耐药性逐年增强，多重耐药不动杆菌、泛耐药不动杆菌检出率日益增高。鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药机制主要为产生碳青霉烯酶，水解碳青霉烯酶类抗生素。碳青霉烯酶包括Ambler分子结构分类的A、B、D 3类酶。A类和D类为丝氨酸酶，D类酶中主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等4型，最主要的是OXA-23、24酶等[9]；B类为金属酶，包括SIM、VIM、IMP等多型，可被EDTA抑制。部分菌株还携带超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、头孢菌素酶(AmpC)和氨基糖苷类修饰酶，可导致一种和几种氨基糖苷类抗生素耐药。2015年数据显示鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的耐药率全国为59.0%，对碳青霉烯类耐药是指对亚胺培南或美罗培南任一药物耐药，这给临床治疗带来极大困难，也对医院感染的控制提出了新要求。因此，提高产碳青霉烯酶不动杆菌检出能力，加强医院感染控制，阻断其传播已至关重要。

本研究中采用Carba NP试验，利用菌株产生的碳青霉烯酶水解亚胺培南/西司他丁钠药物，从而引起酸碱度的改变，使检测液中的酚红产生肉眼可见颜色变化，进行多重耐药不动杆菌碳青霉烯酶的检测，具有良好的时效性、特异性、准确性，从而达到快速检测不动杆菌碳青霉烯酶的目的。本实验方法适合在微生物实验室、疾病控制机构、医院检验科临床微生物室等相关单位广泛推广应用，有助于提高产酶菌株检出的时效性及准确性，为临床治疗及医院感染控制更加有效进行争取宝贵时间。本研究在对33株产碳青霉烯酶不动杆菌耐药基因型分析中，细菌染色体中OXA-23基因型检出率达80%以上，OXA-24基因型检出率达47%，未检出SIM、VIM、IMP等基因型，质粒中未检出OXA-23、OXA-24等基因型，由此提示产D类碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌其耐药性为菌体本身固有存在而非通过质粒传播。产B类碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌耐药基因型检测及其耐药性传播方式仍有待研究。本研究表明本院产碳青霉烯酶多重耐药不动杆菌主要以OXA-23型、OXA-24型产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌为主，携带VIM、IMP等耐药基因型的鲍曼不动杆菌未在本院流行传播。

[1]Senok A,Garaween G,Raji A,et al.Genetic relatedness of clinical and environmental Acinetobacter baumanii isolates from an intensive care unit outbreak[J].J Infect Dev Ctries,2015,9(6):665-669.

[2]Nordmann P,Poirel L,Dortet L.Rapid detection of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae[J].Emerg Infect Dis,2012,18(9):1503-1507.

[3]朱雄，袁敏，刘佳，等．Carba NP碳青霉烯酶检测方法在医院感染监测中的应用[J]．中华医院感染学杂志，2014，24(23)：5721-5724．

[4]张雅薇，王辉．2015年CLSI M100-S25主要更新内容介绍[J]．中华检验医学杂志，2015，38(4)：229-232．

[5]CLSI.M100-S25 performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-fifth informational supplement[M].Wayne,PA:CLSI,2015.

[6]刘运德，楼永良．临床微生物学检验技术[M]．北京：人民卫生出版社，2015：56．

[7]俞刚，陆峰泉，陈瑜，等．耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌OXA和NDM-1耐药基因的研究[J]．中国微生态学杂志，2014，26(11)：1275-1278．

[8]张辉，张小江，徐英春，等．2012年中国CHINET不动杆菌属细菌耐药性监测[J]．中国感染与化疗杂志，2014，5(5)：392-397．

[9]Merino M,Acosta J,Poza M,et al.OXA-24 carbapenemase gene flanked by XerC/XerD-like recombination sites in different plasmids from different Acinetobacter species isolated during a nosocomial outbreak[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2724-2727.

Research on rapid detection of Acinetobacter baumannii produced carbapenemase by CarbaNP method*

JING Yongwei,HU Fangxi,YAN Qi,XIA Mengqi,WANG Dongyue,LIU Xin△

(ShenyangMedicalCollege,Shenyang,Liaoning110034,China)

ObjectiveTo understand the phenotype and enzyme genotype of pan-drug resistant carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii to provide the evidence for clinical rational use of antibiotics and monitoring hospital infection.MethodsA total of 117 clinically isolated strains of Acinetobacter baumannii were collected and performed the routine microbiological detection.Multi-drug resistant Acinetobacter baumannii was screened by K-B disk diffusion method.The phenotype of carbapenemase-producing strains was detected by using the Carba NP colorimetry and modified Hodge test.The drug resistant genotype of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii was verified by PCR.ResultsAmong clinically isolated 117 strains of Acinetobacter baumannii,64 strains were multi-drug resistant Acinetobacter baumannii,in which 33 strains were carbapenemase positive.OXA-23 drug-resistant genotype of carbapenemase was detected by PCR,while IMP,VIM and NDM-1 drug resistant genes were not detected.ConclusionThe CarbaNP method can rapidly detect carbapenemase-producing strains with the advantages of strong sensitivity and simple operation,which conduces to improve the detection rate of carbapenemase-producing strains and monitor the nosocomial infection.

Acinetobacter baumannii;drug-resistant gene;carbapenemase

2016-03-28修回日期：2016-05-23)

辽宁省科学事业公益研究基金项目(GY2013-A-014)；辽宁省大学生创新创业训练项目(20150810)。

荆泳玮，男，沈阳医学院2012级本科学生,临床医学专业。△

，E-mail:syliuxin141236@sina.cn。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.010

A

1673-4130(2016)15-2076-03