人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究*

吴月琴，钟山亮，张晓慧，唐金海，赵建华△

(1．南京医科大学研究生学院，南京 211166；2.南京医科大学附属江苏省肿瘤医院临床检验中心，南京 210009；3.江苏省肿瘤医院普外科，南京 210009)



·论著·

人三阴性乳腺癌细胞耐药株的建立及特性研究*

吴月琴1，钟山亮2，张晓慧2，唐金海3，赵建华2△

(1．南京医科大学研究生学院，南京 211166；2.南京医科大学附属江苏省肿瘤医院临床检验中心，南京 210009；3.江苏省肿瘤医院普外科，南京 210009)

目的建立人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的多西紫杉醇(Doc)耐药模型(MDA-MB-231/Doc)和表阿霉素(Epi)耐药模型(MDA-MB-231/Epi)，探讨其生物学特性。方法采用Doc和EPi低浓度逐步加量诱导法历时12个月分别建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药细胞株。通过细胞形态学观察、MTT法和流式细胞术分析、比较其生物学特性，实时荧光定量PCR检测多药耐药基因(MDR1)mRNA表达，Western Blot法检测P糖蛋白(P-gp)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)的表达状况。结果所构建的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株可分别在12 nmol/L Doc和800 nmol/L Epi中稳定生长，在相同的药物浓度下，耐药细胞株的生长增殖率明显高于亲代细胞，其耐药指数分别为亲代敏感细胞的8.32倍和64.93倍，且相互呈交叉耐药状态。与亲代细胞相比，两株耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、处于S期的细胞减少，随撤药时间的延长，细胞的增殖速度加快。两株耐药株的MDR1基因表达水平增高，分别为亲代细胞的4.05倍和5.96倍，P-gp表达为阳性。与MCF-7细胞株相比，MDA-MB-231细胞株ER、PR、HER2表达阴性，是典型的三阴性乳腺癌细胞株。结论成功建立MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的耐药细胞株，其生长及耐药性稳定。

乳腺癌细胞；多西紫杉醇；表阿霉素；多药耐药

目前，乳腺癌是中国女性发病率最高的癌症，癌症死亡原因位居第六。每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%[1]。三阴性乳腺癌(TNBC)是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的一种特殊类型乳腺癌，约占所有乳腺癌的10%～20%[2]。它们具有特殊的分子表达特征、侵袭行为和转移模式,表现为对传统的内分泌治疗和靶向治疗均不敏感，局部复发和远处转移率高，预后极差。目前，多西紫杉醇(Doc)和表阿霉素(Epi)是三阴性乳腺癌患者最常用的药物，尤其是联合治疗可获得较好的控制效果[3-4]，但药物耐药常导致治疗的最终失败[5-6]。本研究以人三阴性乳腺癌细胞敏感株MDA-MB-231/S为亲本细胞，通过低剂量逐渐加量法体外诱导建立系列耐药细胞株MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi，并对它们的耐药性和生物学特性进行研究，为探讨肿瘤细胞对化疗耐药的机制及体外逆转耐药的策略，克服当前化疗中存在的这一主要障碍构建研究平台。

1　材料及方法

1.1主要试剂与仪器人乳腺癌细胞敏感株MDA-MB-231/S和MCF7/S购买于上海生物制品研究所，引进于美国ATCC。DMEM高糖培养基(HyClone)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶(HyClone)、培养皿、Sigma的四甲基偶氮唑盐(MTT)、兔抗人P糖蛋白(P-gp)单克隆抗体(Abcam)、兔抗人ER单克隆抗体(Abcam)、兔抗人PR单克隆抗体(Abcam)、兔抗人Her-2单克隆抗体(Abcam)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(arigo)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠二抗(北京康为)及HRP标记的山羊抗兔二抗(Cell Signaling)；MDR1引物(由上海闪晶生物公司设计及合成)、超净工作台、倒置相差显微镜、电泳仪、转膜仪、美国BD-FACSCaluibur流式细胞仪等。

1.2方法

1.2.1MDA-MB-231/S细胞培养MDA-MB-231/S和MCF7/S细胞培养于含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养液，置于37 ℃、5%CO2的培养箱培养。细胞用胰酶消化传代。

1.2.2MD2A-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药株的建立在MDA-MB-231/S的基础上，通过低剂量逐渐加量法构建耐药细胞株。Doc的药物浓度从0.2 nmol/L逐步加至13 nmol/L；Epi的浓度从10 nmol/L逐步到800 nmol/L，整个过程历时一年左右。在进行后续试验前，细胞在无药培养基中培养2周以上，以排除药物的影响。

1.2.3细胞的生长曲线、IC50和相对耐药指数(RI)取对数生长期的细胞，制成1×105/mL的单细胞悬液，按每孔100 μL接种于96孔板，培养24 h后加入100 μL含有不同药物浓度的完全培养基，每个药物浓度设4个复孔，同时设置空白对照和阴性对照。培养48 h后，每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h，弃上清液，每孔加150 μL的二甲基亚砜(DMSO)，待晶体彻底溶解后，酶标仪490 nm检测吸光度。计算细胞生长增殖率和生长抑制率：生长增殖率=实验组平均吸光值/对照组平均吸光值×100%；生长抑制率=1-(实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%。以药物浓度的对数作为纵坐标，以细胞生长增殖率作为横坐标，绘制细胞生长曲线；根据细胞生长抑制率计算细胞生长抑制所需的各药浓度(IC50)和RI。RI=耐药细胞的IC50/亲代细胞的IC50。试验独立重复3次。

1.2.4细胞周期分布取对数生长期的细胞用胰酶消化制成1 mL的单细胞悬液，预冷的70%乙醇固定，-20 ℃过夜，PBS洗脱2次，碘化丙啶(PI)避光染色30 min，以美国BD-FACS Calibur流式细胞仪检测细胞周期。独立重复3次。

1.2.5MDR1基因相对定量测定用胰酶消化细胞，总RNA simple Total RNA Kit(离心柱型)试剂盒提取总的RNA，测A260/A280值并计算其纯度和RNA含量；按BU-Script RT KIT 试剂盒说明，反转录合成cDNA。取1 μL cDNA 作为模板进行实时荧光定量PCR(LightCycle LC480扩增仪)。多药耐药(MDR)1引物：上游5′-GTT GCT GCT TAC ATT CAG GTT TC-3′，下游5′-ACC AGC CTA TCT CCT GTC GC-3′；β-actin引物：上游5′-CAC CTT CTA CAA TGA GCT GCG TGT G-3′，下游5′-ATA GCA CAG CCT GGA TAG CAA CGT AC-3′。以2-ΔΔCt计算MDR1 mRNA 的相对表达量。(6)Western Blot 检测ER、PR、Her-2和P-gp的表达：提取蛋白，测蛋白浓度。蛋白上样量由蛋白浓度换算，80 V电泳20 min，120 V电泳2 h；300 mA 湿转2 h；室温5%牛奶封闭1 h；兔抗人P-gp单克隆抗体(1∶2 000)、兔抗人ER单克隆抗体(1∶800)、兔抗人PR单克隆抗体(1∶2 000)、兔抗人HER2单克隆抗体(1∶10 000)及鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶10 000)，4 ℃过夜;HRP标记的山羊抗小鼠二抗(1∶4 000)、HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温1 h；ECL液暗室发光显影。

2　结　果

2.1细胞形态MDA-MB-231/S贴壁生长，呈长梭形或多角形，排列均匀。加入Doc 1周后细胞变细，变长，核染色质变粗糙；加入Epi 1周后细胞胞体变大，核质比增加。加入药物后敏感细胞不断死亡，需数次换液不断清除死细胞，仅存少量贴壁细胞。去药2周后，细胞开始少量成团生长，去药4周后细胞基本恢复。见图1。

图1　倒置显微镜观察多西紫杉醇和表阿霉素作用前后MDA-MB-231/S细胞形态变化(×100)

2.2细胞耐药特性与MDA-MB-231/S相比，在相同的药物浓度下，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi对Doc和Epi有较高的耐药特性(图2)，并且其之间交叉耐药(表1)。

2.3细胞周期经流式细胞仪分析，MDA-MB-231/S的G0/G1期细胞占总细胞的53.70%，G2/M期占16.90%，S期占29.40%，细胞凋亡4.53%；MDA-MB-231/Doc细胞，G0/G1期细胞占总细胞的55.46%，G2/M期占22.33%，S期占22.22%，细胞凋亡1.68%；MDA-MB-231/Epi细胞，G0/G1期细胞占总细胞的61.21%，G2/M期占9.61%，S期占29.10%，细胞凋亡1.58%。结果表明MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi处于G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，凋亡减少。

表1　MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi细胞的耐药特性(n=3)

图2　不同的药物浓度下，MDA-MB-231/S与MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi生长增殖率的比较

2.4MDR1基因相对定量RT-qPCR 结果显示，MDA-MB-231/Doc 细胞MDR1 mRNA 表达水平是MDA-MB-231/S 的4.05倍(P<0.05)；MDA-MB-231/Epi 细胞MDR1 mRNA 表达水平是MDA-MB-231/S 的5.96倍(P<0.05)。见图3。

图3　MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi 细胞MDR1 基因的相对表达

2.5Western Blot 结果结果显示MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi与MCF-7/S相比，ER、PR和Her-2缺失，表现为三阴性。MDA-MB-231/Doc、MDA-MB-231/Epi与MDA-MB-231/S相比P-gp表达阳性。结果见图4。

注：1为MDA-MB-231/S；2为MDA-MB-231/Doc；3为MDA-MB-231/Ep;4：MCF-7/S。

图44株乳腺癌细胞中ER、PR、Her-2 及P-gp蛋白的表达

3　讨　论

MDR是临床化疗急需攻克的难题，其耐药相关机制仍未阐明[7-8]。通过一年低浓度逐渐加量法诱导成功的MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi与MDA-MB-231/S相比，耐药细胞株对Doc、Epi有较强的耐药,并且相互之间交叉耐药。同时耐药细胞株G0/G1期的细胞增加，S期细胞减少，凋亡减少。说明耐药细胞株在建模中经诱导获得耐药性后处于慢周期甚至静息状态，耐药株对化疗药物的敏感度降低，具备了MDR的特性。

P-gp过表达是目前公认的MDR生物学基础，也被认为是耐药细胞经典或最基本的标志[9]。P-gp是人类MDR基因家族中，与耐药有关的MDR1基因编码。它不仅作为药物，外排泵保护细胞免受有毒物质侵袭，而且还可参与细胞的增殖、分化和凋亡，介导MDR产生[10]。RT-qPCR及WesternBlot检测到与亲代细胞相比，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi的MDR1/P-gp表达上调。证实P-gp在Doc和Epi获得性耐药过程中被诱导产生并起关键作用。同时运用人乳腺癌细胞株MCF-7/S与MDA-MB-231/S、MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi相比，三阴性乳腺癌细胞株的ER、PR和Her2表达阴性。进一步说明了与其他类型乳腺癌相比，传统的治疗方法对于三阴性乳腺癌效果不明显。而对于相对有效的化学药物治疗[11-12]，MDA-MB-231/Doc和MDA-MB-231/Epi耐药模型的建立，为进一步深入研究Doc和Epi的耐药逆转机制和三阴性乳腺癌的治疗策略提供了

可靠的实验模型和参考依据。

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Establishment of drug-resistant cell lines of human triple negative breast cancer and study on their characteristics*

WU Yueqin1，ZHONG Shanliang2,ZHANG Xiaohui2,TANG Jinhai3,ZHAO Jianhua2△

(1.GraduateSchool,NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu211166,China;2.ClinicalLaboratoryCentere,AffiliatedJiangsuProvincialTumorHospital,NanjingMedicalUniversity，Nanjing,Jiangsu210009,China;3.DepartmentofGeneralSurgery,JiangsuProvincialTumorHospital,Nanjing,Jiangsu210009,China)

ObjectiveTo establish docetaxel (Doc) resistant MDA-MB-231/Doc model and epirubicin (Epi) resistant MDA-MB-231/Epi mode from triple negative breast cancer cell line MDA-MB-231 and to explore their biological characteristics.MethodsThe MDA-MB-231/Doc and MDA-MB-231/Epi drug-resistant cell lines were respectively established by gradually increasing Doc or Epi concentrations induction method in 12 months.The biological characteristics of the cell lines were compared by the cell morphological observation,MTT and flow cytometry;the real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect multi-drug resistance gene (MDR1) mRNA expression；the expression of P glycoprotein(P-gp),estrogen receptor (ER),progesterone receptor (PR) and human epidermal growth factor receptor 2 (Her-2) was detected by Western Blot.ResultsAfter the 12-month induction,the established MDA-MB-231/Doc could grow stably in the medium containing 12 nmol/L Doc,and MDA-MB-231/Epi could grow stably in the medium containing 800 nmol/L Epi;in the same drug concentration,the growth proliferation rate of the drug resistant cell line was significantly higher than that of the parental generation cells,their drug resistance indexes were 8.32 times and 64.93 rimes of parental generation sensitive cells,moreover which showed the mutual cross drug resistant status.Compared to the parental generation cells,the cells of stage G1and G2in two cell lines were increased and the cells of stage S were decreased,with the prolongation of drug withdrawal time,the cell proliferation speed was accelerated.The expression level of MDR1 gene was increased in the two drug-resistant cell lines，which were 4.05 times and 5.96 times of parental generation cells respectively,P-gp protein expression was positive.Compared with the MCF-7 cell line,ER,PR and Her2 expression in the MDA-MB-231 cell line was negative and typical triple negative breast cancer cell line.ConclusionThe drug resistance cell lines of MDA-MB-231/Doc and MDA-MB-231/Epi are successfully established with stable growth and drug resistance.

triple negative breast cancer cell line;docetaxel;epirubicin;multidrug resistant

2016-01-19修回日期：2016-05-03)

国家自然科学基金资助项目(81272470)。

吴月琴，女，主管检验技师，主要从事乳腺癌分子生物学的研究。△

，E-mail:jhzhao2838@sina.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.001

A

1673-4130(2016)15-2049-03