骨髓细胞髓过氧化物酶染色质控体系的建立

蒋朝晖，邱先艳，余红岚

(贵阳市第一人民医院检验科　550002)



骨髓细胞髓过氧化物酶染色质控体系的建立

蒋朝晖，邱先艳，余红岚△

(贵阳市第一人民医院检验科550002)

目的探讨自制乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝正常外周静脉血片作为骨髓细胞髓过氧化物酶(MPO)染色阳性对照的可能性，初步建立MPO染色的质控体系。方法选取EDTA抗凝的正常外周静脉血制成200张血片，分为不固定组和固定组(95%乙醇固定)，每隔15 d各组取10张血片进行MPO染色，观察其阳性率和积分变化。结果血片中MPO酶活性随着时间推移而减弱，经95%乙醇固定后，其阳性率能维持90 d左右；而MPO阳性积分一直随时间推移而减低，且固定组与不固定组差异无统计学意义(P>0.05)。结论可选用自制EDTA-K2抗凝正常外周静脉血片经95%乙醇固定后作为MPO染色的阳性对照，其有效期约为90 d。

骨髓细胞；髓过氧化物酶染色；外周静脉血；阳性对照；质控体系

目前临床主要依靠骨髓细胞形态学(M)、细胞免疫学(I)、细胞遗传学(C)和分子生物学(M)联合方法(MICM分型)对白血病进行诊断和分型[1]。但部分基层医院受到设备及技术水平的限制，对于白血病的初步诊断还主要依靠形态学。由于白血病细胞的异质性和多态性，加上阅片人员的经验及水平差异，形态学判断符合率较低(64%～77%)，但结合细胞化学染色后，其符合率能提高至86%左右[2-3]。常规或电镜下的骨髓细胞髓过氧化物酶(MPO)染色对辅助判断急性白血病形态学具有重要价值，能初步区分髓系与非髓系[4-5]。但在一些特殊病例中，比如MPO缺失患者[6]，或者个别急性淋巴细胞白血症患者骨髓中原幼淋巴细胞异常增生会抑制其他系统发育，有时会很难见到成熟的粒细胞，即所谓的染色“内对照”很难找到，此时很难判断是真的阴性结果还是试剂失效或操作失误，因此引入质控物尤其是阳性对照对结果判读至关重要。由于MPO染色实验过程受到试剂有效期、环境温度、细胞数量及孵育时间等因素影响，主观性强，很难实现标准化。现有报道多集中在MPO与疾病的相关性，而对于MPO染色实验本身质量控制的报道少见，本研究拟利用自制抗凝外周血片作为阳性对照，摸索其保存时间及保存条件，探讨其作为MPO染色阳性对照的可行性，初步建立MPO染色的质控体系。

1　材料与方法

1.1材料所有标本均来源于贵阳市第一人民医院门诊患者；主要试剂：MPO染色试剂(联苯胺法，珠海贝索生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1选取合适的静脉血制成血片选取的阳性对照血片细胞组成：白细胞9.2×109/L，中性粒细胞占60%、淋巴细胞占34%、单核细胞占5%、嗜酸性粒细胞占1%。制成血片200张，取一半用95%乙醇固定，即分为固定组与不固定组。

1.2.2MPO染色染色步骤严格按照试剂说明书进行：涂片干燥后，滴加联苯胺液数滴(覆盖血膜)，再滴加H2O2数滴(两者比例1∶1)，室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗2 min；甩干，瑞姬氏染液与磷酸盐缓冲液1∶2混合染色3～5 min，流水冲洗，干后镜检。阳性反应呈棕黄色、蓝色至黑色颗粒。为了更准确反映其阳性程度，笔者参照中性粒细胞碱性磷酸酶染色积分判读标准对MPO阳性细胞进行积分：(-)0分，细胞质中无阳性染色颗粒；(+)1分，细胞质中含少量棕黄色颗粒；(++)2分，细胞质中含中等量棕黄色颗粒、蓝色或黑色颗粒；(+++)3分，细胞质中含较多棕黄色、蓝色或黑色颗粒；(++++)4分，细胞质中或整个细胞覆盖黑色颗粒。根据以上判读标准，计数100个白细胞，记录其阳性率及积分。

1.2.3摸索血片的保存条件将制成的血涂片在相对稳定的环境(室温20 ℃，相对湿度40%)中遮光保存，每隔15 d各组取10张血片进行MPO染色，比较其MPO阳性率和积分的变化。

2　结　果

2.1固定组及不固定组外周血MPO染色阳性率受时间影响情况不固定组MPO酶活性能维持60 d左右，60 d后阳性率逐渐下降(P<0.05)；而经95%乙醇固定后，其酶活性能维持更长时间达90 d左右。见图1。

2.2固定组及不固定组外周血MPO染色阳性积分受时间影响情况固定组与不固定组MPO阳性积分随时间逐渐减低(P<0.05)，不固定组与固定组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图1　固定组与不固定组MPO阳性率比较

图2　固定组与不固定组MPO阳性积分比较

3　讨　论

MPO是人体中中性粒细胞内含量最多的一种蛋白质，该酶是粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存在于嗜天青颗粒中的一种血红素蛋白酶，主要存在于中性粒细胞、单核细胞和某些巨噬细胞中[7-9]。MPO阴阳性或者其阳性强度对白血病的鉴别诊断具有重要价值，朱竑等[2]报道MPO的阳性指数强弱顺序为M3>M2b>M2a>M6>M4>M1>M5>ALL。但目前MPO染色均由人工完成，联苯胺工作液有效期很短需要现配，阳性率会受到试剂有效期的影响；而阳性强度又与细胞数量、染色时间及环境温度息息相关；结果判读主观性强。因此，如果没有质控体系，很难保证MPO染色结果的精密度和准确性。

由于关于MPO染色实验本身质量控制的报道少见，本研究首次摸索了自制抗凝外周血片，探讨其作为MPO染色阳性对照的可行性，初步建立MPO染色的质控体系。本研究对阳性对照血片的保存条件和有效期进行了实验验证。实验发现：已知细胞组成的外周血(同时存在较多的中性粒细胞和淋巴细胞)在20 ℃、40%湿度左右的环境中遮光保存，MPO酶活性随着时间推移而减弱，经95%乙醇固定后，其阳性率能维持90 d左右；而MPO阳性积分一直随时间推移而减低，且固定组与不固定组没有明显差异。在随后的工作中，将该质控品应用于标本检测，使用方便，也不存在试剂浪费，较好地起到了质控作用。

综上所述，批量制作已知细胞成分的外周血片，经95%乙醇固定后，可作为MPO染色的阳性对照，其效期约为90 d。今后的研究将集中在选择合适的固定剂或改变保存条件(低温)能否延长其效期；另外，由于中性粒细胞碱性磷酸酶、特异性酯酶同样存在于中性粒细胞中，同一份阳性对照能否同时应用于其他化学染色的实验中都有待实验验证。

[1]Steven HS，Elias C，Nancy LH,et al．WHO classification of tumor of haematopoietic and lymphoid tissues[M]．4 th ed．Geneva Switzerland：World Health Organization，2008：14-36．

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[3]熊树民.急性白血病MICM分型诊断[J].诊断学理论与实践，2002,1(2):76-78.

[4]常军林,巨小英.髓过氧化物酶染色对急性白血病分型诊断的价值[J].吉林医学,2014,35(22):4925-4926.

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2016-04-13修回日期：2016-05-26)

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.041

A

1673-4130(2016)15-2155-03

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