黄芩苷对再灌注心肌细胞保护作用及与心肌细胞自噬的相关性

王鹏，马军军，杜亚明



基础与实验研究

黄芩苷对再灌注心肌细胞保护作用及与心肌细胞自噬的相关性

王鹏，马军军，杜亚明

目的：探讨黄芩苷对再灌注心肌细胞保护作用及与心肌细胞自噬的相关性。

方法：将48只大鼠随机分为4组（n=12）：假手术组，假手术+黄芩苷组，缺血再灌注组，黄芩苷处理组。术前7天每日1次灌胃，建立各组模型。统计各组同时间点的血流动力学及再灌注45 min后心肌梗死面积情况，免疫印迹试验（Western blot）测定再灌注30 min后心肌微管相关蛋白（ LC3-Ⅱ）及自噬体膜标记蛋白（Becl-1）表达情况，再灌注30 min后检测线粒体膜通道转换孔（mPTP）开放情况。

结果： 假手术组和假手术+黄芩苷组心肌梗死面积极小，不便进行比较。缺血再灌注组心肌梗死面积（41.32±1.85）%，黄芩苷处理组心肌梗死面积（23.30±1.60）%，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。再灌注30 min后LC3-Ⅱ及Becl-1蛋白表达量，缺血再灌注组（LC3-Ⅱ：1.051±0.005，Becl-1：1.169±0.002）和黄芩苷处理组（LC3-Ⅱ：0.863±0.009，Becl-1：0.943±0.005）较假手术组（LC3-Ⅱ：0.763±0.007，Becl-1：0.647±0.014）明显增加（P＜0.01）；黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显下降（P＜0.01）。再灌注30 min后烟酰胺腺嘌呤=核苷酸（NAD+）含量（nmol/mg），缺血再灌注组（6.02±0.33）和黄芩苷处理组（9.56±0.53）较假手术组（11.28±0.37）明显下降（P＜0.01）；黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显增加（P＜0.01）。

结论： 黄芩苷对正常心肌细胞自噬无影响，但能显著减少缺血再灌注心肌梗死面积，降低再灌注后的过度自噬发生，其机制可能通过抑制mPTP开放从而减少自噬的相关诱导因素发挥作用。关键词 黄芩苷；心肌再灌注；保护；自噬；

Abstract

Objective： To study the protective effect of baicalin on myocardial ischemia reperfusion injury and its correlation to myocardial cell autophagy in experimental rats.

Methods： The animal models were established by intragastric infusion at 7 days prior operation in different groups. A total of 48 rats were divided into 4 groups： Sham operation group， Sham+baicalin group， Ischemia reperfusion （IR） group and Baicalin treatment group. n=12 in each group. Hemodynamics at different time points and myocardial infarction （MI） size at 45 min after reperfusion were recorded； protein expressions of LC3-II and autophagy-related Becl-1 at 30 min after reperfusion were examined by Westernblot analysis； the opening condition of mitochondrial membrane channel transition pore （mPTP） was detected by NAD+ content.

Results： The MI sizes in Sham operation group and Sham+baicalin group were too small to compare； MI sizes in IR group and Baicalin treatment group were （41.32±1.85） % vs （23.30±1.60） %， P＜0.001. Protein expressions of LC3-II in IR group and Baicalin treatment group were （1.051±0.005） and （0.863±0.009） which were both higher than Sham operation group （0.763±0.007）， P＜0.01；Becl-1 were （1.169±0.002） and （0.943±0.005） which were both higher than Sham operation group （0.647±0.014）， P＜0.01； LC3-II and in Becl-1 expressions in Baicalin treatment group were decreased than IR group， P＜0.01. NAD+ contents （by nmol/mg） in IR groupand Baicalin treatment group were （6.02±0.33） and （9.56±0.53） which were both lower than Sham operation group （11.28±0.37），P＜0.001； NAD+ content in Baicalin treatment group was increased than IR group， P＜0.01.

Conclusion： Baicalin had no autophagy effect in normal myocardial cells， but it may decrease the MI size and reduce excessive autophagy in myocardial cells after IR which might be related to inhibiting mPTP opening.

（Chinese Circulation Journal， 2016，31：701.）

急性心肌梗死后尽早开通梗死相关血管是挽救濒死心肌关键。然而，缺血心肌恢复血供后，心肌细胞损伤会加重，甚至产生更大范围的损伤。近年的研究表明，自噬在心肌缺血再灌注过程中发挥很重要的作用［1］，适度的自噬有利于减轻细胞损伤，过度自噬能加重心肌细胞损伤［2，3］，而心肌缺血再灌注过程中自噬被过度激活［3］，同时线粒体膜通道转换孔（mPTP）开放能诱导细胞自噬死亡［4］。实验研究表明，在缺血-再灌注过程中，黄芩苷能减少肝脏及脑组织梗死面积［5-7］，而其在心肌缺血再灌注过程中的研究很少。本实验重点研究黄芩苷在心肌缺血再灌注中对心肌保护作用及其作用相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠48只，体重230～250 g，由辽宁医学院动物实验中心提供。灌流装置购于美国RADNOTI公司，MP150多导生理记录分析系统购于美国BIAPOC公司，克-亨氏（K-H）试剂购于西陇化工有限公司。左心室压力测定使用泰盟BL-420S生物机能实验系统，2，3，5-氯化三苯基四唑（TTC）试剂购于北京科博赛而科技有限公司，黄芩苷原料药购自浙江江北药业。

1.2 实验分组及模型建立

将48只大鼠随机分为4组，假手术组，假手术+黄芩苷组，缺血再灌注组，黄芩苷处理组，每组12只。本实验采用的体外模拟缺血再灌模型参照了Hernando等［8］诱导心肌细胞死亡的模型。20%乌拉坦（5 μl/g）麻醉，肝素静脉注射，迅速开胸，取出心脏放至4℃预冷的K-H液中，经主动脉逆行插管悬挂于Langendorff灌流装置，用K-H液（恒压80 cm H2O， 恒温37℃， 通以 95%O2+5%CO2混合气）灌注。K-H液成分（g/L）：NaCl26.896， KCl 0.343，CaCl2. H2O 0.4115， MgSO47，H2O 0.296， KH2PO40.1635， NaHCO32.1005， EDTA.2Na 0.372，葡萄糖 1.000，去离子水配制，调pH值为7.4。术前7天每日1次灌胃：假手术组、缺血再灌注组用2 ml生理盐水，假手术+黄芩苷组、黄芩苷处理组用100 mg/kg的黄芩苷与2 ml生理盐水混匀灌胃；取出心脏后假手术组、假手术+黄芩苷组分别随机7只用K-H液持续灌流90 min，另外5只用K-H液持续灌流105 min；缺血再灌注组、黄芩苷处理组用K-H液稳定灌流30 min，37℃水浴中缺血30 min，分别随机7只再灌注30 min，另外5只再灌注45 min。

所有组灌流20 min时测冠状动脉流量，再灌后30、45 min 2个时间点测冠状动脉流量。左心室压力检测：心脏挂至灌流装置后，插入球囊，球囊内注有2.5 ml生理盐水，另一端连接换能器，记录左心室发展压（LVDP）， 左心室内压变化速率（±dp/ dtmax）及心率。随着时间推移及心肌再灌注损伤的作用，心肌功能逐渐降低，进行不同时间点各组内比较误差较大，故只进行相同时点各组间的比较。上述所有实验组中，每组5个心脏，采集血流动力学指标。

1.3 心肌切片染色

用 TTC染色法［9，10］来确定心肌梗死面积。心脏再灌注45 min后立即取下心脏于-20℃冷冻1 h后切片，薄而均匀，1% TTC 37℃避光染色5 min，然后10%福尔马林固定10 min，观察梗死区（白色）和存活区（红色），用图象分析仪处理得面积百分比。本组使用心脏为各组检测完灌流指标的心脏，每组5个心脏。

1.4 免疫印迹试验（Western blot）检测心肌微管相关蛋白（LC3-Ⅱ），自噬体膜标记蛋白（Becl-1）蛋白表达量

通过测定LC3-Ⅱ，Becl-1蛋白表达量，有助于了解自噬的发生情况［11］。再灌注30 min时取左心室心尖部加入组织裂解液裂解，离心取蛋白沉淀。BCA法［12］测蛋白浓度。SDS-PAGE 凝胶电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭硝酸纤维素膜 2 h，洗膜后加入LC3-Ⅱ（北京博奥森生物技术有限公司）、Becl-1（Abgent公司）一抗，4℃反应过夜，次日洗膜，随后加入辣根过氧化物酶标记二抗（生兴生物技术有限公司），室温反应1 h。洗膜，利用辣根过氧化物酶的化学显色反应（HRP-ECL）X片显影。以β肌动蛋白（β-actin）为内参。用Quality One图象分析软件，根据光密度定量分析。用凝胶图像分析系统分析灰度值（n=3）。

1.5 mPTP开放性检测

组织中90%以上的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）存在于线粒体内，心肌缺血后再灌注时，NAD+通过开放的 mPTP从失活的及功能不全的线粒体中被灌注液冲洗掉，因此，心肌组织中的NAD+ 含量的高低能反映mPTP的开放程度，含量越低说明mPTP的开放程度越大，线粒体损伤程度越重［13，14］。NAD+/NADH 检测试剂盒是基于乙醇脱氢酶的循环反应。NAD 可被乙醇脱氢酶还原为NADH，NADH 通过吩嗪硫酸甲酯（PMS）的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒。通过在565 nm 条件下测定 MTT 的还原速度（吸光度值变化）可反映出 NAD+的含量。本研究中，缺血后再灌注30 min取左心室心肌组织约20 mg的心肌组织，用4℃PBS缓冲液清洗。进行匀浆化。置于1.5 ml Eppendorf 管中，加入100 μl NAD+ 提取缓冲液，在60℃水浴下热提取约5 min。然后加入20 μl 检测缓冲液和100 μl NADH提取缓冲液以中和提取物，充分混匀。在 17000 g 离心力下离心5 min，取上清液进行测定。制备不同浓度的 NAD+标准品。在96孔板中，每孔加入40μl样品或标准品。后每个孔内迅速加入80 μl工作液，混匀。用酶标仪在565 nm条件下测定OD0（反应开始时刻的吸光度值），室温孵育15 min 后，测定OD15。根据标准曲线，计算NAD+的含量（n=4）。

1.6 统计学分析

应用SPSS statistics 17.0统计软件。计量资料以±s表示，采取t检验，方差分析方法比较各组间数据。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌再灌注期间心功能监测指标的比较（表1）

再灌注20 min时，各组心功能差异无统计学意义（P＞0.05）。再灌注30 min，45 min时，与假手术组相比，缺血再灌注组、黄芩苷处理组心功能明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与缺血再灌注组相比，黄芩苷处理组心功能明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠心肌再灌注期间心功能监测指标的比较（n=5，±s）

表1 各组大鼠心肌再灌注期间心功能监测指标的比较（n=5，±s）

注：LVDP：左心室发展压；+dp/dtmax：左心室内压最大上升速率；-dp/dtmax：左心室内压最大下降速率；1 mmHg=0.133 kPa。与假手术组比*P＜0.01；与缺血再灌注组比△P＜0.01。

项目　　再灌注20 min　再灌注30 min　再灌注45 min心率 （次/min）假手术组　271±3　267±5　270±7假手术+黄芩苷组　272±7　272±9　272±5缺血再灌注组 　269±6　188±7*　178±6*黄芩苷处理组　275±5　235±8*△　239±5*△冠状动脉流量 （ml/min）假手术组 　10.1±0.5　9.9±0.8　9.3±0.4假手术+黄芩苷组　10.1±0.3　10.1±0.5　9.2±0.4缺血再灌注组 　10.2±0.6　5.5±0.4*　4.7±0.3*黄芩苷处理组　10.4±0.5　7.6±0.5*△　7.5±0.4*△LVDP （mmHg）假手术组 　81.1±2.5　80.5±2.0　83.3±1.9假手术+黄芩苷组　78.5±5.4　81.3±2.3　81.6±1.0缺血再灌注组 　81.6±2.6　46.8±1.5*　46.2±0.8*黄芩苷处理组　79.5±3.5　62.0±1.8*△　60.6±1.9*△+dp/dtmax （mmHg/s）假手术组 　2652±67　2572±50　2533±58假手术+黄芩苷组　2630±111　2584±85　2593±31缺血再灌注组 　2708±109　1238±89*　1197±76*黄芩苷处理组　2616±128　1763±94*△　1642±72*△-dp/dtmax （mmHg/s）假手术组 　1728±77　1668±123　1713±127假手术+黄芩苷组　1746±80　1635±104　1784±103缺血再灌注组 　1730±55　648±52*　686±24*黄芩苷处理组　1709±82　1143±83*△　1087±107*△

2.2 各组大鼠心脏再灌注45 min后心肌TTC染色结果（图1）

假手术组和假手术+黄芩苷组心肌梗死面积极小，不便进行比较。缺血再灌注组心肌梗死面积（41.32±1.85）%，黄芩苷处理组心肌梗死面积（23.30±1.60）%，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.3 各组大鼠心肌再灌注30 min后LC3-Ⅱ，Becl-1蛋白表达量及NAD+含量的比较（表2，图2）

再灌注30 min后LC3-Ⅱ及Becl-1蛋白表达量，缺血再灌注组和黄芩苷处理组较假手术组明显增加（P＜0.01）；黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显下降（P＜0.01）。再灌注30 min后NAD+含量，缺血再灌注组和黄芩苷处理组较假手术组明显下降（P＜0.01）；黄芩苷处理组较缺血再灌注组明显增加（P＜0.01）。

图1 各组大鼠心肌再灌注45 min后心肌2，3，5-氯化三苯基四唑染色结果

表2 各组大鼠心肌再灌注30 min后LC3-Ⅱ、Becl-1蛋白表达量及NAD+含量比较（±s）

表2 各组大鼠心肌再灌注30 min后LC3-Ⅱ、Becl-1蛋白表达量及NAD+含量比较（±s）

注：LC3-Ⅱ：心肌微管相关蛋白；Becl-1：自噬体膜标记蛋白；NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。与假手术组比*P＜0.01；与缺血再灌注组比△P＜0.01

NAD+含量（n=4，nmol/mg）假手术组　0.763±0.007　0.647±0.014　11.28±0.37假手术+黄芩苷组 0.763±0.012　0.606±0.006　11.50±0.73缺血再灌注组　1.051±0.005*　1.169±0.002*　6.02±0.33*黄芩苷处理组 　0.863±0.009*△　0.943±0.005*△　9.56±0.53*△组别 　LC3-Ⅱ（n=3）Becl-1 （n=3）

图2 各组大鼠心肌再灌注30 min时心肌LC3-Ⅱ、Becl-1蛋白含量比较

3 讨论

冠心病是21世纪人类面临的重要挑战，其主要发病原因是心脏血液供应障碍导致心肌梗死。目前，治疗心肌梗死主要采用溶栓治疗和急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI），以开通闭塞血管，挽救缺血、濒死心肌［15］。然而，心肌缺血与再灌注均可导致心肌细胞损伤、甚至坏死，是引起冠心病患者发生心力衰竭的主要原因。随着科学的进步，人们逐渐发现缺血再灌注时除了引起心肌细胞的坏死和凋亡外，还引发心肌细胞自噬现象［16］。

自噬由自噬相关基因（Atg）进行调控，大多数Atg参与自噬的形成。在适宜的条件下生长因子信号与酪氨酸激酶受体（TKR）结合，能活化Ⅰ类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）蛋白，后者通过AKT信号通路激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），活化的mTOR能抑制诱导细胞自噬的关键信号分子Atg1的表达，从而起到抑制细胞自噬的作用。营养条件不适宜时（如缺血、缺氧等），mTOR不被激活，Atg1的抑制因素缺失，Atg1与Atg11、Atg13、Atg17 形成复合物，成为细胞自噬的诱导信号，进一步激活Atg6 （Becl 1）、Ⅲ类PI3K复合物及Atg14，激活Atg12、Atg16、Atg5、Atg7复合物，从而募集Atg8（LC3）形成自噬体。其中LC3可以一直存在于自噬体中，可作为自噬体形成的标志［3］。Matsui等［2］进行的大鼠研究表明， 在心肌再灌注阶段，Becl1表达大幅度上调，Becl 1为细胞自噬发生过程中的重要Atg，其表达的明显增加提示心肌细胞自噬现象的大量出现。

心肌缺血实质上属于营养物质的不足，当心肌缺血发生时自噬现象增加，关于心肌自噬现象，很多年前人们就进行过报道。近年来，关于心脏缺血再灌注时诱发自噬的因素我们进行大量的研究，其包括缺血、低氧、ATP 耗竭和缺血预适应、内质网应激、活性氧簇（ROS）等，损伤的细胞器对诱发自噬也具有重要作用［4，17］。缺血再灌注损伤能引起线粒体功能障碍，包括心肌能量合成受阻，离子稳态失衡及自由基的大量产生等［18］。mPTP是缺血再灌注后心肌细胞损伤的一个重要因素。最近的研究发现，在再灌注开始的前几分钟，mPTP开放的抑制在缺血预适应心肌保护中发挥重要的作用［19，20］。一些mPTP 开放的抑制剂如环孢素A（CsA）已经证明具有保护心肌对抗缺血再灌注的作用［21］。同时多项研究报道表明，线粒体的碎裂和损伤可以诱发自噬，心肌细胞缺血再灌注损伤后mPTP的开放同样可以诱导自噬［4］。

黄芩苷是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性，具有抗炎、抗变态及解痉作用［22］。黄芩苷在各种病理生理条件下被广泛研究［23-25］。黄芩苷及其苷元黄芩素体外保护心肌损伤作用也得到很好的证实［26，27］。而黄芩苷作用于缺血心肌细胞有关自噬的情况和mPTP是否介导黄芩苷抗心肌缺血再灌注损伤尚少见报道。

本实验通过体外循环灌流装置，除外神经、体液及自身前后负荷的等各方面影响，验证黄芩苷能够对缺血再灌注心肌细胞发挥保护作用，同时进一步研究其发挥保护作用的机制，测定LC3-Ⅱ，Becl-1蛋白量成功反映出其通过抑制过度自噬而对心肌细胞发挥保护作用，为研究其在心肌保护中的作用提供新思路。但是，本实验结果没能够证实黄芩苷在非缺血心肌细胞刺激自噬的发生。mPTP的开放能诱导自噬发生，通过对NAD+的检测，客观的反应再灌注过程中mPTP开放情况，从而提出在黄芩苷作用于再灌注心肌，减轻过度自噬发生是否与抑制mPTP的开放有关，为其作用机制的研究提供新的方向。其进一步的作用机制值得更深层次的研究。

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（编辑：王宝茹）

Protective Effect of Baicalin on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury and its Correlation to Myocardial Cell Autophagy in Experimental Rats

WANG Peng， MA Jun-jun， DU Ya-ming.
Department of Cardio-thoracic Surgery， First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College， Jinzhou （121001）， Liaoning， China
Corresponding Author： DU Ya-ming， Email：duyaming521@163.com

Baicalin； Myocardial reperfusion； Protection； Autophagy

辽宁省省直医院临床能力建设项目（LNCCC-D29-2015）；辽宁省科技厅博士启动项目（20141135）

121001 辽宁省锦州市，辽宁医学院附属第一医院 胸心外科（王鹏、杜亚明），组织工程重点实验室（马军军）

王鹏 硕士研究生 研究方向为冠心病的诊断与治疗 Email：297915691@qq.com 通讯作者： 杜亚明 Email：duyaming521@163.com

R54

A

1000-3614（2016）07-0701-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2016.07.019

（2015-12-27）