RIP1在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡中的作用探讨*

周翔宇，郑英强，何雪梅

(西南医科大学附属医院血管和甲状腺外科，四川泸州 646000)



RIP1在急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡中的作用探讨*

周翔宇，郑英强，何雪梅

(西南医科大学附属医院血管和甲状腺外科，四川泸州 646000)

目的探讨细胞凋亡在急性胰腺炎炎症中的作用及受体相互作用蛋白(RIP)的调控作用。方法将30只C57小鼠分为3组：对照组、急性水肿性胰腺炎(AEP)组、急性坏死性胰腺炎(ANP)组。AEP组连续注射雨蛙素(50 μg/kg)13次；ANP组连续注射雨蛙素(50 μg/kg)13次，另注射1次脂多糖(15 mg/kg)；对照组注射等量生理盐水7次。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法观察胰腺腺泡细胞凋亡，实时荧光定量PCR法检测RIP1 mRNA的表达，蛋白质免疫印迹法检测RIP1蛋白的表达。结果成功建立AEP及ANP小鼠模型。与对照组比较，2个胰腺炎模型组均存在细胞凋亡，且与AEP组比较，ANP组小鼠细胞凋亡减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，AEP组RIP1 mRNA及蛋白表达均升高，而ANP组降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论RIP1参与急性胰腺炎的发病过程，可能与调控腺泡细胞凋亡有关。

急性胰腺炎；水肿性胰腺炎；坏死性胰腺炎；细胞凋亡；受体相互作用蛋白

急性胰腺炎是多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎性反应。现有的研究认为，实验性胰腺炎炎症程度与腺泡细胞的凋亡呈负相关[1]。胰腺腺泡细胞的凋亡对于急性胰腺炎的临床转归是一个有利的保护性反应[2]。但胰腺腺泡细胞凋亡的调控机制尚不明确。本研究建立急性水肿性胰腺炎(acute edematous pancreatitis，AEP)和急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)小鼠模型，检测两种模型胰腺腺泡细胞凋亡及凋亡调控基因受体相互作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)在胰腺腺泡细胞的表达，进一步探讨细胞凋亡在胰腺炎症中的作用及相关调控机制。

1　材料与方法

1.1实验动物30只雄性C57小鼠购自重庆腾鑫生物技术有限公司，10周龄,体质量22～24 g。

1.2仪器与试剂雨蛙素和脂多糖均购自美国Sigma公司，血清淀粉酶和脂肪酶检测试剂盒均购自南京建成生物制品研究所，Trizol及SYBR Green Master Mix试剂均购自美国Life Technologies公司，StepOne Plus实时荧光定量PCR系统购自美国ABI公司，荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TUNEL)试剂盒购自瑞士Roche公司,RIP单克隆抗体和内参β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，二抗购自美国Abcom公司。

1.3方法

1.3.1模型建立急性胰腺炎动物模型的建立参考文献[3]。将所有动物于实验前适应性喂养1周，术前禁食12 h，自由饮水。将30只小鼠分为3组：对照(CON)组、AEP组、ANP组。AEP组小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，连续7次，每次间隔1 h；ANP组小鼠腹腔注射雨蛙素50 μg/kg，连续13次，每次间隔1 h，在最后1次注射雨蛙素时加注1次脂多糖(15 mg/kg)；CON组腹腔注射与雨蛙素相同剂量的生理盐水，注射7次。

1.3.2标本收集和组织学检测于最后1次注射后3 h用3%戊巴比妥钠(0.1 mL/100 g)行腹腔内注射麻醉，下腔静脉抽取血液0.5～1.0 mL，3 000 r/min离心10 min分离血浆，试剂盒测定血清淀粉酶和脂肪酶含量。取胰腺组织，常规固定，石蜡包埋，连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，行病理检查。

1.3.3TUNEL法检测胰腺腺泡细胞凋亡每只小鼠蜡块任选3张切片，二甲苯脱蜡后，按照说明书测定细胞凋亡情况。加 TUNEL反应液，再加入转化剂-POD(converter-POD)，然后与二氨基联苯胺(DAB)反应显色，光学显微镜观察并计数。TUNEL阳性表达率=阳性表达细胞数/细胞总数×100%。

1.3.4实时荧光定量PCR检测RIP mRNA的表达取胰腺组织，每块1 cm3，迅速置于-80 ℃冻存。引物序列，RIPF：5′-CGG GTG TCA GGA ATC AAA TC-3′，RIPR：5′-TGG AAG GTC TCG CAA ATA CTG-3′；β-actinF：5′-AGG GTG TGA TGG TGG GAA T-3′，β-actin R：5′-CTC GGT GAG CAG CAC AGG-3′。按照RNA抽提试剂盒的操作步骤，取冻存胰腺组织50 mg提取总RNA，并利用紫外分光光度计对提取的RNA浓度进行测定，并制备cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测RIP mRNA。经过最后的循环后，用PCR扩增仪自带软件进行荧光定量分析。实时荧光定量PCR检测结果使用比较阈值法进行定量分析，分析方法采用2-△△Ct方法。

1.3.5蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测RIP蛋白在胰腺组织的表达按蛋白提取试剂盒说明书提取各组小鼠胰腺组织总蛋白。蛋白浓度由二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒测定。对所提取的蛋白样品进行电泳、转膜、封闭后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。加入过氧化物酶(HRP)标记的二抗，电化学发光(ECL)法显色。用Quantity One软件测定各条带的积分吸光度值。鼠单克隆抗体β-actin作为内参对照。

2　结　　果

2.1病理切片观察AEP组小鼠胰腺呈现典型AEP改变,小叶间隙增宽、水肿、充血，有中性粒细胞和单核细胞浸润，腺泡细胞肿胀，但小叶结构完好，未见明显出血坏死，部分细胞内脂质空泡形成。ANP组小鼠胰腺组织结构破坏明显，小叶排列紊乱，叶间有明显的炎性反应、水肿，小叶边缘区大量腺泡细胞坏死，局部有融合性坏死灶，局部血管壁出血、坏死，脂肪组织坏死。CON组病理切片未见明显异常。见图1。

2.2各组血清淀粉酶及脂肪酶水平比较AEP组与ANP组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平较对照组均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；且ANP组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平均高于AEP组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组胰腺组织凋亡率比较TUNEL法检测对小鼠胰腺组织凋亡情况，凋亡细胞的核呈棕黄色，染色质凝聚、浓缩。与对照组相比较，胰腺炎造模小鼠胰腺腺泡细胞凋亡增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与AEP组比较，ANP组中TUNEL阳性表达细胞减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A:CON组；B:AEP组；C：ANP组。

图1各组小鼠胰腺病理学改变(HE染色，×200)

A:CON组；B:AEP组；C：ANP组。

图2TUNEL法检测各组小鼠胰腺腺泡细胞凋亡(DAB染色，×200)

2.4RIP1 mRNA的表达各组小鼠胰腺组织RIP1 mRNA表达水平，见图3。与对照组(2-△△Ct值为1.00)比较，AEP组胰腺组织RIP mRNA表达水平(2-△△Ct值为1.90)增加；ANP组小鼠胰腺组织RIP mRNA表达(2-△△Ct值为0.30)较AEP组减少。

2.5RIP1蛋白的表达各组胰腺组织RIP蛋白的表达，见图4。AEP组小鼠胰腺组织RIP蛋白表达较对照组明显增加；与AEP组比较，ANP组胰腺组织RIP蛋白的表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　　各组小鼠血清淀粉酶及脂肪酶水平比较

*：P<0.05，与CON组比较；#：P<0.05，与AEP组比较。

*：P<0.01，与CON组比较。

图3各组小鼠胰腺组织RIP1 mRNA表达

图4　　各组小鼠胰腺组织RIP1蛋白的表达

3　讨　　论

急性胰腺炎临床病变程度轻重不等，轻者以胰腺水肿为主，临床多见，病情常呈自限性，预后良好。而重症患者胰腺病变常表现为出血坏死，临床经过凶险，死亡风险高。胰腺病理变化的轻重程度和急性胰腺炎的临床表现密切相关，但是调控胰腺炎症严重程度的具体因素尚不明确。本研究成功建立了水肿型和坏死型两种急性胰腺炎小鼠模型，探讨这两种不同炎症程度急性胰腺炎的可能影响因素。

腺泡细胞死亡是急性胰腺炎症过程中的重要病理特征，因此探讨腺泡细胞死亡的机制具有重要意义[4]。研究认为，腺泡细胞的坏死和凋亡共同存在于急性胰腺炎的不同病理类型中。凋亡是受调控的细胞自主的程序性死亡，胰腺腺泡细胞凋亡可保护腺泡细胞损伤，并可减轻胰腺炎症程度[5]。本研究发现，AEP小鼠胰腺腺泡细胞凋亡较ANP小鼠明显增多，显示胰腺炎性病变的严重度和细胞凋亡呈负相关，诱导胰腺腺泡细胞的凋亡可能在一定程度上减轻胰腺的炎症程度。

过去细胞坏死被视为不受信号调控的无序过程，而最近的研究证实细胞坏死也存在程序性调控，称为程序性坏死。RIP是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞的凋亡与存活、程序性坏死等过程中发挥着关键性的作用[6]。RIP1为RIP家族中的第1个成员，其介导的细胞程序性坏死在调控细胞死亡中起重要作用，抑制RIP1可以减轻坏死性细胞死亡，这已经被有关脑出血、肝脏缺血再灌注、小肠缺血等体内和(或)体外的研究所证实[7-8]。有关RIP1在胰腺炎中的作用，以往研究用雨蛙素诱导胰腺炎，RIP水平和细胞坏死程度直接相关。Liu等[9]通过体外实验也证实RIP1可介导细胞坏死。本研究则是分别用雨蛙素及雨蛙素加脂多糖诱导不同的胰腺炎模型，探讨RIP1的表达情况。结果显示：AEP小鼠胰腺组织中RIP1 mRNA及蛋白表达均较ANP小鼠明显增加，证实RIP1参与了急性胰腺炎的发生、发展过程。相较于单独使用雨蛙素，加用脂多糖后，基因水平和蛋白水平都证实RIP1表达明显降低，说明脂多糖抑制了RIP1的表达。

有关坏死调控蛋白RIP1在胰腺炎中的具体作用机制，目前尚不清楚。Yao等[10]研究证实，RIP1通过调节死亡受体介导巨噬细胞的自噬和凋亡。在胰腺癌细胞中敲除RIP1后，原本对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)诱导凋亡抵制的细胞变得对TRAIL诱导凋亡异常的敏感，说明RIP1有抑制细胞凋亡的作用[11]。Nikseresht等[12]也证实，抑制RIP1可减轻脂多糖诱导的细胞凋亡。其机制是，抑制RIP1发挥抗炎效应，且增加了抗氧化活性[12]。结合本研究结果，AEP组小鼠的细胞死亡以凋亡为主，坏死较少，而调控程序性死亡的RIP1却明显增加；ANP组小鼠的细胞死亡以坏死为主，凋亡较少，此时RIP1却明显减少。造成这种差异的原因目前尚不清楚，笔者推测可能是AEP过程中细胞坏死更多接受程序性调控，而ANP可能以非程序性调控坏死为主。是否RIP1介导的程序性死亡和细胞凋亡通过相互调控而发挥作用，其具体的机制是后续研究关注的重点。

[1]Xu P，Lou XL，Chen C，et al．Effects of peroxisome proliferator-activated receptor-γ activation on apoptosis in rats with acute pancreatitis[J]．Dig Dis Sci，2013，58(12)：3516-3523．

[2]Fortunato F，Bürgers H，Bergmann F，et al．Impaired autolysosome formation correlates with Lamp-2 depletion: role of apoptosis,autophagy,and necrosis in pancreatitis[J]．Gastroenterology，2009，137(1)：350-360．

[3]郑英强，黄娟，曾凡才，等．雨蛙素及脂多糖在小鼠急性胰腺炎建模中的应用[J]．世界华人消化杂志，2014，22(27)：4068-4074．

[4]Lewarchik CM，Orabi AI，Jin S，et al．The ryanodine receptor is expressed in human pancreatic acinar cells and contributes to acinar cell injury[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，307(5)：G574-G581．

[5]Li N，Wu X，Holzer RG，et al．Loss of acinar cell IKKα triggers spontaneous pancreatitis in mice[J]．J Clin Invest，2013，123(5)：2231-2243．

[6]Dhingra R，Lin J，Kirshenbaum LA．Disruption of RIP1-FADD complexes by microRNA-103/107 provokes necrotic cardiac cell death[J]．Circ Res，2015，117(4)：314-316．

[7]Su X，Wang H，Kang D，et al.Necrostatin-1 ameliorates intracerebral hemorrhage-induced brain injury in mice through inhibiting RIP1/RIP3 pathway[J]．Neurochem Res，2015，40(4)：643-650．

[8]Matsuoka Y，Tsujimoto Y．Role of RIP1 in physiological enterocyte turnover in mouse small intestine via nonapoptotic death[J]．Genes Cells，2015，20(1)：11-28．

[9]LiuY，YangL，ChenKL，etal．Knockdown

of GRP78 promotes apoptosis in pancreatic acinar cells and attenuates the severity of cerulein and LPS induced pancreatic inflammation[J]．PLoS One，2014，9(3)：e92389．

[10]Yao Z，Zhang P，Guo H，et al．RIP1 modulates death receptor mediated apoptosis and autophagy in macrophages[J]．Mol Oncol，2015，9(4)：806-817．

[11]Humphries F，Yang S，Wang B，et al．RIP kinases: key decision makers in cell death and innate immunity[J]．Cell Death Differ，2015，22(2)：225-236．

[12]Nikseresht S，Khodagholi F，Nategh M，et al．RIP1 inhibition rescues from LPS-induced RIP3-mediated programmed cell death,distributed energy metabolism and spatial memory impairment[J]．J Mol Neurosci，2015，57(2)：219-230．

Study on role of RIP1 in apoptosis of pancreatic acinar cell in acute pancreatitis*

ZhouXiangyu，ZhengYingqiang，HeXuemei

(DepartmentofVascularandThyroidSurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the role of apoptosis and the regulating role of receptor interacting protein 1(RIP1) in acute pancreatitis.MethodsThirty C57 mice were divided into three groups: control group,acute edematous pancreatitis (AEP) group and acute necrotizing pancreatitis (ANP) group.The AEP group was continuously injected by cerulein 50 μg/kg for 13 times,the ANP group was continuously injected by cerulein 50 μg/kg for 13 times and lipopolysaccharide 15 mg/kg once; the control group was injected by the same volume of normal saline for 7 times.The acinar cell apoptosis was observed by the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling (TUNEL) assay.The RIP1 mRNA expression was measured by real time fluorescence PCR.The expression of RIP1 protein was detected by Western blotting.ResultsThe mouse models of AEP and ANP were established successfully.Compared with the control group,acinar cell apoptosis existed in both AEP and ANP model groups,moreover compared with the AEP group,apoptosis in the ANP group were decreased,the differences were statistically significant(P<0.05).Compared with the control group,the expression of RIP1 mRNA and protein in the AEP group was increased,while which in the ANP group were decreased,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionRIP1 participate in the pathogenesis of acute pancreatitis,which may associate with acinar cell apoptosis.

acute pancreatitis；edematous pancreatitis；necrotizing pancreatitis；apoptosis；receptor interacting protein

国家自然科学基金资助项目(81100272)；四川省科技厅基金资助项目(2014JY0004)。作者简介：周翔宇(1977-)，副主任医师，博士，主要从事急性胰腺炎发病机制与免疫相关研究。

R576

A

1671-8348(2016)21-2894-03

2016-01-26

2016-04-13)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.004