低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

陈苗苗，董金杰，杜平

(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046)

低血清培养的BHK21细胞染色体遗传稳定性分析

陈苗苗，董金杰，杜平

(中农威特生物科技股份有限公司，甘肃 兰州 730046)

目的:分析1种商业化的低血清培养基适应BHK21细胞进行传代培养，该细胞染色体的变异稳定性，以判定其质量。方法:采用直接法制取4个代次的BHK21细胞的染色体标本，用常规Giemsa染色，1 000倍光学显微镜下计数中期分裂相染色体数目，求出染色体变异率(%)，并进行核型分析。结果:BHK21为亚二倍体或亚四倍体细胞系，亚二倍体众数为42，亚四倍体细胞众数为72～74，该细胞系染色体的畸变率在各代次所占的比例为0～2%，均较低。结论:用商业化的低血清培养基驯化培养BHK21细胞，逐渐降低培养液中血清含量，进行传代培养，通过选取不同代次细胞的染色体进行核型分析，该细胞系的遗传学特性相对稳定，各代次间无本质差异，可候选为制苗用细胞。

低血清;BHK21细胞;染色体;遗传稳定性

BHK21是源于幼仓鼠肾的一种传代细胞系［1，2］。由于BHK21细胞对口蹄疫病毒敏感，且又是口蹄疫病毒很好的宿主细胞，所以在口蹄疫疫苗生产中，都使用BHK21细胞对口蹄疫病毒进行繁殖。无论是传统的转瓶工艺还是悬浮培养工艺，都以贴壁的BHK21细胞为驯化对象，由权威机构的ATCC保存的BHK21细胞，在其介绍中明确说明，此传代细胞遗传上具有一定的变异性。为了能够保证口蹄疫病毒生产的高效性，保证宿主细胞的遗传稳定性则是重中之重。目前能够检测细胞变异系数的有效方法就是核型分析，这是细胞遗传学及细胞生物学的核心基本技术之一。这一技术可以用于研究细胞和组织及个体的特异性鉴定、遗传变异、种属进化关系。

目前医院常采用外周血、骨髓、羊水制备染色体用于诊断染色体上的疾病［3，4］，很少有文献介绍传代细胞的核型分析技术。然而传代细胞具有驯化成熟、人为控制性强的特点，在实际科研、检验、疫苗生产以及生物制品研发等领域中被广泛应用，所以传代细胞的核型分析也显得十分重要。本研究以低血清培养适应的BHK21细胞进行传代培养，染色体标本制备的标准参考翁炳焕等［5］提出的考评标准，其中［6］可分析分裂相的要求为数目明确、全部染色体集中但不重叠、染色体伸展适度，着丝粒清晰、染色清晰，取4个代次400个中期分裂相的染色体进行分析，判定该细胞系的畸变率，以此为依据筛选优良的细胞株。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要试剂:秋水仙素、卡诺氏固定液、固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)、吉姆萨染色液、25 g/L胰蛋白、胎牛血清、KCL。

1．1．2 细胞:BHK21细胞:购自中国兽药监察所，由中农威特生物科技股份有限公司质量保证部保存，按常规组织培养法进行培养和传代。

1．1．3 培养基:MEM细胞培养基为GIBCO公司产品，MEM SLM低血清细胞培养基为北京清大天一生物技术有限公司产品，新生牛血清为兰州民海生物技术公司产品。

1．2 方法

图1 F4(201培养液+10%血清)细胞形态图

1．2．1 细胞培养:将复苏的BHK21细胞在T75的培养瓶中适应低血清培养基培养32代，其中F1～F8代为传统201培养液+10%血清培养的BHK21细胞，F9～F16代为商业化低血清培养基+5%血清培养的BHKL21细胞，F17～F25代为商业化低血清培养基+4%血清培养的BHKL21细胞，F26～F32代为商业化低血清培养基+3%血清培养的BHKL21细胞，细胞驯化过程中，每个代次BHK21细胞长势稳定，形态良好。驯化稳定的4个代次F4、F9、F18、F27 BHK21细胞48 h培养形态分别见图1、图2、图3、图4。

图2 F9(MEM SLM+5%血清)细胞形态图

图3 F18(MEM SLM+40%血清)细胞形态图

图4 F27(MEM SLM+3%血清)细胞形态图

1．2．2 染色体标本制备:参照《四种动物传代细胞染色体遗传变异率分析》中染色体标本制备的方法，将5代、10代、20代、30代作为细胞染色体分析的代次，于细胞终止培养前5～6 h，在细胞培养物中加入适量的秋水仙素溶液，使秋水仙素的最终浓度为0．01 μg/mL培养液，以便阻止细胞有丝分裂至中期，到培养结束时，倾弃培养液加入适量25 g/L胰蛋白酶消化液对细胞单层进行消化，收集细胞，再加入预热至37℃的75 mmol/L KCL溶液5～6 mL，室温下低渗30 min，离心倾弃上清液，然后加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)5 mL固定30 min后，离心10 min(800～1 000 r/min)，重复固定1次，置于4℃过夜，次日离心倾弃上清液，沉淀加1 mL新配的固定液制成细胞悬浮液，在冰水浸泡的干净玻片上滴加细胞悬浮液3～4滴，室温下晾干，即制成培养细胞有丝分裂中期的染色体玻片标本。

1．2．3 染色体的Giemsa染色［7］:染色体玻片标本可于室温下放置1周，或37℃干燥2～4 h后，即可作染色体的Giemsa染色，用pH 6．8的磷酸盐缓冲液配成100 g/L的Giemsa染色液，滴在染色体玻片标本上，染色30 min，蒸馏水冲洗干净，晾干。

1．2．4 染色体的观察与分析:每个代次选择100个中期分裂相细胞，油镜(10×100)下计数染色体数目，并观察记录畸变染色体，计算出染色体的畸变率，每种血清含量培养的细胞选择1个分裂良好的的中期分裂相拍摄显微照片，并作核型分析。

2 结果与讨论

共计数了BHK21细胞系的5、10、20、30代次，400个中期分裂相的染色体，染色体数目分布见表1。

表14 个代次染色体数目分布

从表1染色体的数目分布可以看出，BHK21属于亚二倍体和亚四倍体系，5、10、30代次主要是亚二倍体细胞系，其中亚二倍体细胞(染色体数目32～67)所占的比例分别为76%、80%、79%，亚四倍体细胞(染色体数目为68～87)，所占比例分别为23%、20%、20%。20代主要是亚四倍体细胞(染色体数目为68～87)，所占比例为68%。染色体的畸变率在各代次所占的比例为0～2%，染色体畸变率很低。因此，该细胞经驯化，用低血清培养基培养后，不同的血清用量、各代次之间无本质差异，遗传学特性相对稳定，可候选为制苗用细胞。4个代次各1个细胞中期分裂相图分别见图5、图6、图7、图8。

图5 F5代(201培养液+10%血清)细胞中期分裂相

图6 F10代(MEM SLM+5%血清)细胞中期分裂相

图7 F20代(MEM SLM+4%血清)细胞中期分裂相

图830 (MEM SLM+3%血清)细胞中期分裂相

［1］Umene K，Nishimoto T．Replication of herpes simplex virustype 1 DNA is inhibited in a temperature－sensitive mutant of BHK－21 cells lacking RCC1(regulator of chromo-some condensation)and virus DNA remains linear［J］．J Gen Virol，1996，77(10):2261－2270．

［2］Slam MQ，Islam K，Levan G，et al．Monochromosome transfers to syrian hamster BHK cells via microcell fusion provide functional evidence for suppressor genes on human chromosome 9 both for anchorage independence and for tumorigenicity［J］．Genes Chromosomes Cancer，1995，13(2):112－115．

［3］张桂林，卫小静，郑梅玲．918例孕中期羊水细胞染色体核型分析［J］．中华医学遗传学杂志，2012，29(1):102－104．

［4］张旺东，王秋菊．染色体核型分析在白血病分型诊断和预后判断中的临床意义［J］．国际检验医学杂志，2010，31(12):1359－1363．

［5］翁炳焕，任宇珂，朱瑞建，等．染色体制备及核型分析室内控制标准及其考评标准的探讨［J］．中国产前诊断杂志，2013，5(2):40－44．

［6］黄燕，陈绍坤．动物骨髓细胞染色体标本制备失败的原因分析［J］．生物学通报，2006，42(1):52－54．

［7］郭健民，张耀平，刘瑞清，等．常用实验动物肿瘤染色体的研究［J］．遗传学报，1980，7(4):376－381．

The Chromosome Genetic Stability Analysis of BHK21 Cells with Low Serum Culture

Chen Miaomiao，Dong Jinjie，Du Ping
(China Agricultural VET．BIO．Sciece and Technology co．，LTD，Lanzhou Gansu 730046，China)

Objective to determine the quality of a commercial low serum medium，which is adapted to BHK21 cells for subculture．Methods Chromosome samples from four BHK21 cells were obtained by direct method．Using conventional Giemsa staining，the number of metaphase mitotic chromosomes was counted by 1 000 times optical microscope．Find out the rate of chromosome mutation，and karyotype analysis．Result:BHK21 is a sub sub diploid or tetraploid cell line，hypodiploid mode was 42，hypotetraploid cell mode was 72～74．The chromosome aberration rate of the cell line was 0～2%，which was lower than that of the generation．Conclusion domestication and culture of BHK21 cells with commercial low serum medium．To gradually reduce the content of serum in the culture medium．Passage culture．By selecting the chromosome of different generations of cell karyotype analysis，the genetic characteristics of the cell line is relatively stable，there is no essential difference between the generations，can be used as a candidate for the production of cells．

Low Serum;BHK21;Chromosome;Genetic Stability

Q813．1+1

A

1007－1474(2016)04－0009－04

2016－05－27

国家高新技术研究发展计划(“863”计划2011AA10A211)

陈苗苗(1980—)，女，硕士，助理研究员，主要从事生物制品研发工作。E－mail:wuyuedexuecmm@163．com