细胞凋亡显像剂18F-ML-10前体合成及放射性标记

桂　媛，徐志宏, 张晓军，李云刚，刘　健，张锦明,*

1.华益科技有限公司，江苏 常熟　215522；2.中国人民解放军总医院 核医学科，北京　100853



细胞凋亡显像剂18F-ML-10前体合成及放射性标记

桂媛1，徐志宏1, 张晓军2，李云刚2，刘健2，张锦明2,*

1.华益科技有限公司，江苏 常熟215522；2.中国人民解放军总医院 核医学科，北京100853

摘要：18F-2-(5-氟-戊基)-2-甲基丙二酸(18F-ML-10)是一个有潜力的细胞凋亡显像剂。以5-溴-1-戊醇为原料，合成了前体：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，采用国产MF-2V-IT-1模块，经亲核取代及碱水解，合成了18F-ML-10；粗产品经HPLC纯化及固相萃取，得到18F-ML-10注射液。18F-ML-10的合成效率为(25.3±4.7)%(n=16, 不校正)，产品的放射化学纯度大于99%，比活度为740 PBq/mol，K2.2.2含量低于10 mg/L，有机溶剂乙腈残留量为(0.015±0.01)%(质量分数)，无菌、无热原符合要求，产品满足临床研究需求。

关键词：18F；放射性合成；放射药物；细胞凋亡；PET

肿瘤细胞凋亡显像是早期评价肿瘤放化疗疗效的方法之一, 影像学评价细胞凋亡的方法很多, 但特异性方法较少。第一个特异性肿瘤细胞凋亡显像剂是99Tcm标记的Annexin V，临床研究表明：肿瘤摄取99Tcm-Annexin V与其凋亡正相关[1-2]。18F-ML-10(2-(5-fluoro-pentyl)-2-methyl malonic acid)是近年来第一个应用于临床研究的凋亡显像的正电子药物, 用于脑胶质瘤放疗后疗效早期评价, 临床初步验证：胶质瘤经放疗后24 h，肿瘤摄取18F-ML-10与治疗后8周的核磁共振成像(MR)图像改变正相关，说明18F-ML-10是一个有潜在临床价值的细胞凋亡显像剂[3-5]。Sobrio等[6]报导了以丙二酸二叔丁基酯为起始原料，合成18F-ML-10的前体：5-对甲苯磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二叔丁基酯；该前体的保护基团为叔丁基酯，脱保护需用强酸。Dewkar等[7]报导了以2-甲基丙二酸二乙酯为起始原料，合成了另一个前体：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，该前体的保护基团为乙酯，较容易脱保护。本研究在文献[6—7]的基础上改变原料，合成较容易脱保护的前体：5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，采用国产氟多功能模块合成18F-ML-10,并进行质量控制，以便将18F-ML-10应用于临床研究。

1　试剂和仪器

甲苯磺酸吡啶盐、5-溴-1-戊醇、碘化钾(KI)、 对甲苯磺酸吡啶盐、 3,4-二氢吡喃、甲基丙二酸二乙酯、 氢化钠、二甲基甲酰胺(DMF)、对甲苯磺酰氯，均为分析纯，购自阿拉丁试剂；K2.2.2、氧-18水(丰度大于97%)，江苏华益科技有限公司；SEP-PAK QMA，美国Waters公司；无水乙腈，美国Aldrich公司。

Agilent 6120型质谱仪，美国安捷伦公司；Bruker 300M核磁共振仪，美国布鲁克公司；SGWX-4熔点仪，上海精密仪器厂；Sumitomo HM-20S 回旋加速器，日本住友公司；MF-2V-IT-1型氟多功能合成仪，派特(北京)科技有限公司；高效HPLC分析仪，美国Waters公司，配有515泵、2487紫外分析仪、BioScan流动放射性检测器；GC7890型气相色谱，上海天美公司。上海三爱思精密试纸(pH=5.5～9.0)。

2　实验方法

18F-ML-10前体及ML-10标准品合成路线示于图1。

2.15-溴-1-戊-1-二氢吡喃醚(1)的合成

氮气保护下，在500 mL三颈瓶中加入4 g对甲苯磺酸吡啶盐(PPTS，16 mmol)、13.36 g 5-溴-1-戊醇(80 mmol)和200 mL二氯甲烷，滴加10.08 g 3,4-二氢吡喃(120 mmol)的200 mL二氯甲烷的溶液。滴完后，室温下反应过夜。停止反应，用水洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤得粗品m=25 g，粗品过300～400目的硅胶柱分离(V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)从5∶1到2∶1梯度洗脱)。

图1　18F-ML-10前体及ML-10标准品合成路线Fig.1　Reaction scheme for precursor of 18F-ML-10 and ML-10 reference standards

2.25-二氢吡喃醚-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯(2)的合成

装置氮气保护，加入7 g甲基丙二酸二乙酯(40 mmol)，50 mL无水DMF，冷至0 ℃，分批加入1.5 g 氢化钠(质量分数80%，48 mmol)，加完后在0 ℃反应0.5 h； 0 ℃下，加入0.6 g KI(3.6 mmol)，后滴加10 g 物质1(40 mmol)的50 mL无水DMF的溶液，加完后升至50 ℃反应过夜。加入饱和氯化铵溶液，调节pH值至中性，加入乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，干燥，产品2可直接进行下一步反应。

2.35-戊醇-2-甲基丙二酸二乙酯(3)的合成

500 mL单颈瓶中依次加入13.7 g 物质2、1.6 g PPTS(6.4 mmol)、180 mL乙醇，在55 ℃下回流反应2 h。停止反应，旋干溶剂，柱分离可得产品(柱分离洗脱剂V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=2∶1)。

2.45-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯(4)的合成

装置氮气保护，依次加入10 g 物质3、5.76 g 三乙胺(57 mmol)和100 mL二氯甲烷，冷至0 ℃，滴加10.86 g对甲苯磺酰氯(57 mmol)溶于100 mL二氯甲烷的溶液，约1 h滴完，滴完后室温下反应过夜。停止反应，反应液用饱和食盐水洗涤后，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，旋干得粗品，粗品柱分离可得产品(柱分离洗脱剂V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=4∶1)，产物为无色透明液体，纯度大于98%。

2.52-(5-氟-戊基)-2-甲基丙二酸(标准品)的合成

装置氮气保护，250 mL三颈瓶中依次加入5 g物质4、100 mL乙腈和3.9 g无水四丁基氟化铵(TBAF，15 mmol)，回流反应2 h。停止反应，减压旋去溶剂，加入约100 mL二氯甲烷然后用2×30 mL水洗涤。有机相干燥，过滤，旋干得粗品。粗品过柱分离可得纯品5-氟-2-甲基丙二酸二乙酯(ML-6)(柱分离洗脱剂V(乙酸乙酯)∶V(正己烷)=10∶1)。

100 mL反应瓶中依次加入0.5 g ML-6(1.9 mmol)、0.76 g氢氧化钠(19 mmol)和20 mL乙醇回流反应约2 h，停止反应，用盐酸调节pH值至强酸性，过滤，滤饼用少量乙醇洗涤，滤液旋干，残渣加约10 mL乙酸乙酯，过滤掉不溶性的无机盐，滤液再次旋干得粗品，粗品用正己烷和乙酸乙酯重结晶可得产品。

2.618F-ML-10的自动化合成

由Sumitomo HM-20S 回旋加速器20 MeV质子轰击丰度为98%的氧-18水，经18O(p,n)18F反应生成18F离子，将18F离子传到QMA柱，以下由MF-2V-IT-1型氟多功能合成器自动化合成。依序将安装在合成器的液体加入，加入1号瓶液体(1 mL的乙腈水溶液，含15 mg K2.2.2和 3 mg K2CO3)，将18F(40～60 GBq)从QMA柱上淋洗入反应管，加热反应管并通入110 mL/min的氮气，将反应管中溶液蒸发至干；加2号瓶内液体(2 mL乙腈), 重复以上步骤，将反应管中溶液蒸发至干；加入3号瓶液体(1 mL乙腈溶解10 mg的5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯)，83 ℃加热反应管5 min ；加入4号瓶液体(0.6 mL 2 mol/L NaOH)115 ℃加热反应管水解10 min，加入5号瓶液体(4 mL 1 mol/L HCl)中和, 最后加入6号瓶液体(2 mL含1%三氟乙酸(TFA)的20%(体积分数，下同)乙腈)。最终约4 mL的反应液自动移到半制备HPLC上分离，半制备分离柱为：Grace Attach C-18 柱(250 mm×10 mm)，流动相为含1%TFA的20%乙腈，流速为12 mL/min。收集9～10 min的放射性峰，经合成器上固相萃取系统，将含20%乙腈的溶液转化成含8%乙醇的注射液。

2.718F-ML-10的质量控制

18F-ML-10应为无色透明的溶液，用精密pH试纸测其pH应在6.0～7.0。

取10 μL的18F-ML-10注射液，于美国Waters公司的高效HPLC分析仪上分析，HPLC分析柱为反相C-18柱(Nova ParK C-18，150 mm×3.9 mm)，流动相为含1%TFA的20%乙腈，流速为1 mL/min。氟离子的tR=1.9 min,18F-ML-10的tR=5.8 min，产品的放化纯应大于95%。产品与ML-10标准品共注射进样(1 g/L),紫外波长为254 nm,18F-ML-10放射性峰应与ML-10的紫外吸收峰一致。

取衰变后的18F-ML-10注射液与等体积的标准K2.2.2(100 mg/L)溶液混合，取3 μL点样于经氯铂酸和碘化钾染色的TLC硅胶板上得到A点，同时另取3 μL标准K2.2.2(50 mg/L)、标准K2.2.2(10 mg/L)溶液点样硅胶板上得到B点、C点, 取3 μL衰变后的18F-ML-10注射液点样于硅胶板上得到D点。硅胶板上的A点和B点的深蓝色斑块应一致，同时D点的蓝色斑块应小于B点[8]。

取已完全衰变的5 μL18F-ML-10注射液，按文献[8]方法测残留乙腈的含量，乙腈含量应不高于0.04%(质量分数)。

按中国药典 2015 年版二部附录Ⅺ E和H检查注射液的内毒素和无菌性，应符合要求。

3　结果与讨论

3.1ML-10标准品和前体合成与表征

本研究以5-溴-1-戊醇为原料，最终合成了ML-10标准品和前体。

其中化合物1:纯品m=13.7 g，合成产率68%； LC-MS[M+1]+=251(100%),253(97%)；1H NMR(300 MHz，CDCl3)：δ=4.55～4.60(m,1H)，3.81～3.92(m,1H)，3.69～3.80(dt,1H,J=6.4 Hz、9.7 Hz)，3.46～3.55(m，1H)，3.35～3.45(dt,1H,J=6.4 Hz、9.7 Hz)，3.39～3.45(t,2H,J=6.8 Hz)，1.86～1.97(m,2H)，1.46～1.85(m,10H)。化合物2:粗产品m=2.3 g，产率72.8%, LC-MS：[M+1]+=345，由于直接用于下步反应，没有做核磁鉴定。化合物3:m=6.4 g，化合物2和3两步总产率61.5%； LC-MS：[M+1]+=261；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.12～4.23(q,4H,J=7.3 Hz)，3.56～3.69(t，2H，J=6.1 Hz)，1.76～1.92(m,2H)，1.46～1.65(m,3H)，1.32～1.46(m,2H)，1.40(s,3H)，1.17～1.31(m,2H)，1.21～1.27(t,6H,J=7.3 Hz)。化合物4:m=12.4 g，合成收率78.9%；LC-MS:[M+1]+=339；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.12～4.26(m,6H)，3.00(s,3H)，1.81～1.90(m,2H)，1.69～1.80(m,2H)，1.36～1.49(m，2H),1.40(s,3H)，1.20～1.35(m,2H)，1.20～1.28(t，6H)。化合物5：m=250 mg，合成收率47%；LC-MS：[M+1]+=415；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=7.74～7.82(d，2H，J=8.3 Hz)，7.29～7.39(d,2H,J=8.3 Hz)，4.11～4.21(q,4H,J=7.1 Hz)，3.96～4.04(t,2H,J=6.3 Hz)，2.45(s,3H)，1.74～1.84(m,2H)，1.61～1.70(m,2H)，1.36(s,3H)，1.19～1.27(t,6H,J=7.1 Hz)，1.12～1.38(m,4H)。化合物6：LC-MS：[M+1]+=207；1H NMR(300 MHz,CDCl3)：δ=4.31～4.56(dt,2H,J=6.0、47.4 Hz)，1.86～1.98(m,2H)，1.61～1.82(m,2H)，1.50(s,3H)，1.29～1.55(m,4H)。

Sobrio等[6]采用丙二酸二叔丁基酯与5-溴戊苄醚反应，再经甲基化后，在钯碳催化下还原苄醚生成5-羟基-戊基-2-甲基丙二酸二叔丁基酯，合成步骤多，所用催化剂价格贵[6]。Dewkar等[7]采用2-甲基丙二酸二乙酯与1,5-二溴戊烷直接反应，生成5-溴-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，经甲基磺酸银将其转化成5-羟基-戊基-2-甲基丙二酸二乙酯，同样使用了贵金属试剂。本研究综合了二种方面的特点，用3,4-二氢吡喃替代苄基保护，用PPTS可以较容易脱保护，降低了合成成本。本研究从原料到前体共4步，合成总收率为33.4%,高于文献[6]的28%。

3.218F-ML-10的自动化合成结果

采用MF-2V-IT-1型多功能模块，单个反应管即能全自动合成18F-ML-10，并完成半制备HPLC的分离和HPLC流动相的溶剂转换得到注射液。 图2为半制备HPLC的放射性色谱图，仅见二个峰，一个是未反应的氟离子峰，另一个即为产品18F-ML-10的峰，说明本反应较单一，没有其它副反应。从氟离子到产品18F-ML-10花费时间40 min, 合成效率为(25.3±4.7)%(n=16，未衰减校正)，衰减校正后的合成效率为32.6%，该效率低于文献[6]的39.8%。但文献[6]为小剂量合成，起始18F量为35～70 MBq，低于本研究18F量三个数量级，本研究的产品活度为10～15 GBq，满足临床使用要求。

图2　半制备HPLC的18F-ML-10放射性色谱图Fig.2　Semipreparative radioactive HPLC traces for 18F-ML-10

3.318F-ML-10的质量控制结果

经溶剂转换后的含w=8%乙醇的18F-ML-10注射液为无色透明的液体，溶液pH=6.5。

产品的活度为10～15 GBq，活度浓度为1.0～1.5 TBq/L。

完全衰变后的18F-ML-10注射液点样于硅胶板上得到D点没有斑点形成，基本无色、无色环，低于标准K2.2.2( 10 mg/L)溶液的色斑C点。符合我国关于18F-FDG注射液中K2.2.2含量低于50 mg/L的要求[9]。

经分析型HPLC分析表明，在HPLC柱上仅一个放射性主峰，该峰的保留时间与ML-10标准品的紫外吸收峰保留时间一致(图3)，18F-ML-10的放射化学纯度大于99%, 比活度为740 PBq/mol。

图3　18F-ML-10的分析型HPLC放射性(B)和ML-10标准品的紫外色谱图(A)Fig.3　18F-ML-10 radioactivity(B) and ML-10 UV traces(A)

经GC分析表明，有机溶剂乙腈的残留为(0.015±0.01)%(质量分数)。

注射液的内毒素和无菌性，符合要求。

4　结　论

本研究以5-溴-1-戊醇为原料，合成了前体5-甲基磺酰基戊基-2-甲基丙二酸二乙酯和标准品F-ML-10，用3,4-二氢吡喃替代苄基保护，用PPTS可以较容易脱保护，降低了合成成本。同时采用国产氟多功能模块，自动合成了18F-ML-10，合成效率为(25.3±4.7)%，18F-ML-10放射化学纯度大于99%，K2.2.2含量低于10 mg/L，

乙腈含量低于0.04%(质量分数)，产品满足临床研究的需求。

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收稿日期：2015-04-21；

修订日期：2015-11-19

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81371593)

作者简介：桂媛(1981—)，女，江西九江永修人，博士，高级工程师，从事有机合成工作 *通信联系人：张锦明(1965—)，男，江苏南通人，博士，研究员，从事核医学工作，E-mail: zhangjm301@163.com

中图分类号：R817

文献标志码：A

文章编号：0253-9950(2016)03-0188-05

doi：10.7538/hhx.2016.38.03.0188

Synthesis Precursor of Apoptosis Imaging Agent18F-ML-10 and Its Radiolabing With18F

GUI Yuan1, XU Zhi-hong1, ZHANG Xiao-jun2, LI Yun-gang2, LIU Jian2, ZHANG Jin-ming2,*

1.Huayi Science & Technology Co. Ltd., Changshu 215522, China;2.Department Nuclear Medicine, The PLA General Hospital, Beijing 100853, China

Abstract:18F-2-(5-fluoro-pentyl)-2-methyl malonic acid(18F-ML-10) is one of the competitive candidate for apoptosis imaging with PET. ML-10 as reference and its OTs derivative (diethyl 2-methyl-2-(5-(tosyloxy)pentyl) malonate) as precursor for labeling with fluorine-18 were prepared.18F-ML-10 was synthesized via nucleophilic substitution and base hydrolysis. The18F-ML-10 injection was got by semi-HPLC and solid-extraction-preparation via home MF-2V-IT-1 module. The synthesis yield of18F-ML-10 is (25.3±4.7)%(n=16, no corrected decay), and the specific activity is 740 PBq/mol. The radiochemical purity is over 99%. The residuary acetonitrile in the injection is (0.015±0.01)%(w). The K2.2.2 mass concentration in the injection is low than 10 mg/L. The injection is free of bacteria and pyrogen. It can be used for clinical research.

Key words:18F; radiosynthesis; radiopharmaceuticals; apoptosis; PET