陕南白山羊伪结核棒状杆菌分离鉴定及灭活铝胶疫苗研制

蔡俊波，王爱玲，李海敏，李春燕，焦阳阳,3，张彦明*，郭抗抗*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省安康市石泉县后柳镇农业综合服务站,陕西石泉 725200；3.陕西省延安市安塞县真武洞镇畜牧兽医站,陕西安塞 717400)



陕南白山羊伪结核棒状杆菌分离鉴定及灭活铝胶疫苗研制

蔡俊波1,2，王爱玲1，李海敏1，李春燕1，焦阳阳1,3，张彦明1*，郭抗抗1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省安康市石泉县后柳镇农业综合服务站,陕西石泉 725200；3.陕西省延安市安塞县真武洞镇畜牧兽医站,陕西安塞 717400)

摘要：羊干酪性淋巴结炎又称羊伪结核病，是由伪结核棒状杆菌感染引起的一种人畜共患慢性接触性传染病，对山羊危害最为严重，目前尚无有效治疗措施。陕西省石泉县陕南白山羊饲养量较大，羊群也存在伪结核棒状杆菌的感染，造成较大的经济损失。为筛选对当地伪结核棒状杆菌敏感的药物和研制灭活疫苗，本研究从疑似伪结核病患羊采取多份新鲜的脓液，进行细菌分离鉴定；对获得的1株分离菌进行药物敏感性试验并用其研制灭活疫苗。结果显示，分离菌在固体培养基上形成白色、干燥、扁平、不透明、边缘整齐的中等大小菌落，革兰染色阳性，经16 S rRNA检测和序列分析，证实分离到的菌株为羊伪结核棒状杆菌。药物敏感性试验结果显示，该分离菌对环丙沙星、头孢曲松、红霉素、卡那霉素、头孢噻肟、妥布霉素、强力霉素、庆大霉素、氯霉素高度敏感；对四环素、利福平、链霉素中度敏感。以该分离菌为种子菌制备的灭活铝胶疫苗无菌检验合格，试验接种山羊无不良反应，目前已经在采样羊场进行临床应用，进一步评价免疫效果。关键词：伪结核棒状杆菌；分离鉴定；药敏试验；灭活疫苗

伪结核棒状杆菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis)可引发羊体表及内脏出现脓肿，浓汁呈现干酪样，因其多发生在局部淋巴结，故被称为伪结核病，也有人根据发病症状称其为干酪性淋巴结炎(Caseous lymphadenitis,CLA)。该病对山羊的危害性较大，感染羊虽然不会在短时间内出现较高的病亡率，但随着该病的持续发展与传播蔓延，对羊群的危害逐渐凸显，患病羊主要出现消瘦，甚至零星死亡，且一旦羊场受到该菌感染后难以清除[1]。因此，坚持羊群临床检查，对疑似病羊及早确诊，对病羊采取隔离治疗或淘汰成为当前解决该病的主流思路[2]。羊伪结核棒状杆菌除了感染羊外，也可以引起人及其他动物感染，是一种人畜共患的慢性传染病病原。有报道称从一名患有坏死性淋巴结炎的12岁女孩的病料中扩增到伪结核棒状杆菌FRC41的全基因序列[3]；也有猪感染伪结核棒状杆菌的报道[4]。因此，对该病的危害应引起足够的重视。

陕南白山羊是秦巴山区饲养的主要山羊品种，养殖陕南白山羊是山区群众脱贫致富的重要途径，现有存栏量约140万只。近期石泉县陕南白山羊饲养户多反映饲养的羊群中有部分羊在下颌部浅表淋巴结、肩部浅表淋巴结和腹股沟浅表淋巴结的一处或多处出现一个或者多个较大脓包，形成初期脓包触之有坚硬感，后期触之有波动感，病羊自身无痛感。为探明其病因，及时向养殖户提供有针对性的治疗方案，减少对养殖效益的影响，维护公共卫生安全，我们从散养户、规模场及养殖专业合作社中选取羊体表出现有脓包的羊场，采集疑似患羊病变部位新鲜的脓液，进行细菌分离鉴定和药敏试验，并进行灭活疫苗的研制和初步应用，以期为这些羊场该病的防控提供依据和基础材料。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源于石泉县后柳镇散养户、规模场以及养殖专业合作社的羊群中病羊的肩部、下颌部、腹股沟处脓包的脓汁共计30份，其中肩部采样9份，下颌部11份，腹股沟处10份。将无菌采集的病料加入甘油生理盐水(甘油与生理盐水按1∶1比例混合)，置-4 ℃保存待检。

1.1.2主要试剂绵羊血平板培养基按常规配制；常用药敏片，杭州天合微生物试剂有限公司产品；2×TaqPCR Master MiX、Maker D L 2 000，北京康为科技有限公司产品；细菌DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒，天根生化科技有限公司产品；pMDl8-T 载体、DH5α感受态细胞，TaKaRa公司产品；40 g/L氢氧化铝凝胶，西安赫特生物科技有限公司产品；其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1细菌分离纯化在无菌条件下，用接种环分别挑取保存的病料划线于血平板培养基，置于37 ℃恒温箱中培养24 h～48 h，观察菌落的形态，挑取单个菌落的一半进行革兰染色镜检，根据镜检结果将疑似菌落的另一半重新接种于血平板培养基进一步进行细菌培养和纯化。

1.2.2引物设计采用通用细菌16 S rRNA 引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，引物使用浓度为10 μmol/L。引物序列为：

16 S-F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16 S-R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′[5]。PCR产物预期大小为1 500 bp。

1.2.3细菌16 S rRNA的PCR检测将纯化的细菌接种于5 mL含有50 mL/L血清LB溶液中，置于37 ℃、200 r/min摇床中培养10 h～12 h。取3 mL菌液按照细菌DNA提取试剂盒说明步骤提取DNA，剩余菌液置-4 ℃保存待用。PCR反应体系包括：2×TaqPCR Master MiX 10 μL，上、下游引物各1 μL，细菌DNA 1 μL，灭菌双蒸水补至总体积20 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 10 min; 94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40个循环；72 ℃ 7 min。将PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段按照胶回收试剂盒说明进行回收，将纯化的PCR产物与pMD18-T连接，纯化的重组质粒送至北京华大基因公司进行序列测定。

1.2.4分离菌的药敏试验根据分离菌的16 S rRNA序列分析，将培养特性、染色镜检及序列分析均符合伪结核棒状杆菌的菌液接种到10 mL含有50 mL/L血清LB溶液中，置于37 ℃、200 r/min摇床中培养10 h～12 h。对培养菌进行计数并保菌，取1 mL菌液调整细菌数为0.5麦氏度，再以无菌操作均匀涂布到含50 mL/L绵羊血的血平板培养基上，在每个平板上依次以梅花桩形式放置5片药敏片，置37 ℃恒温箱培养24 h～48 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，依照美国临床实验室标准化委员会颁布的《抗微生物药物敏感性试验执行标准》(抑菌圈直径≥20 mm为高度敏感，直径在15 mm～20 mm之间为中度敏感，直径<15 mm为耐药)判定药敏试验结果。

1.2.5分离菌的铝胶灭活疫苗试制将分离菌菌液作为制作灭活铝胶疫苗的种子液，无菌操作均匀涂布在含200 mL/L血清的培养基上，置于37 ℃恒温箱培养48 h～72 h。用50 g/L灭菌生理盐水冲洗培养基，并用涂布棒将菌液收集至已灭菌并带有玻璃珠的锥形瓶中，充分摇晃使菌液均匀混浊。按收获菌液体积5 mL/L加入5 mL/L甲醛溶液，置37 ℃、200 r/min摇床中灭活24 h～48 h。然后无菌取灭活后的菌液接种到含50 mL/L绵羊血的血平板上，置37 ℃培养24 h，观察是否有细菌生长。若无菌落长出说明已完全灭活。通过比浊法将菌液浓度调整到6×109CFU/mL，最后按等体积加入40 g/L氢氧化铝凝胶[6]，充分乳化均匀，分装，密封，贴签，保存。1.2.6无菌检查疫苗制备好后，随机取样做无菌检查，即在无菌条件下，从已配制好的疫苗中取出1 mL涂布于50 mL/L血平板上，置37 ℃培养48 h～72 h,观察是否有菌落生长。

1.2.7安全性检查随机选取健康陕南白山羊20只分为2组，每组中各有2只刚断奶山羊，2只3月龄山羊，6只6月龄以上山羊，一组按疫苗1 mL/只，另一组按2 mL/只肌肉注射免疫，免疫接种后连续观察20 d看接种羊有无不良反应，接种部位是否异常。

2　结果

2.1细菌分离纯化

将采集的脓汁分别划线于含50 mL/L绵羊血的血平板培养基上，37 ℃培养24 h～48 h，血平板上出现白色、干燥、扁平、不透明、边缘整齐、易推动的圆形菌落，将血平板对着光线，可以在菌落周围清晰的看到溶血环(图1)。革兰染色后镜检，可见单个或栅格状的革兰阳性球状短杆菌(图2)，分离菌从菌落形态和染色特性上与羊伪结核棒状杆菌相似。

2.2分离菌16 S rRNA鉴定结果

疑似菌的DNA，利用细菌16 S rRNA通用引物进行PCR扩增后，获得长度为1 500 bp的扩增产物(图3)，序列分析表明，分离得到1株疑似菌与羊伪结核棒状杆菌16 S rRNA序列的同源性为99.5%，可以确定该分离菌为羊伪结核棒状杆菌(图4)。

2.3药敏试验结果

分离菌药敏试验结果如表1。从表1可以看出该菌对环丙沙星、头孢曲松、红霉素、卡那霉素、头孢噻肟、妥布霉素、强力霉素、庆大霉素、氯霉素等抗菌药物高度敏感；对四环素、利福平、链霉素等中度敏感。

2.4灭活疫苗无菌检测结果

试制的铝胶灭活疫苗置37 ℃培养72 h，未见细菌生长。

2.5灭活疫苗安全性检查结果

20 d的观察期内，山羊注射部位没有发生肿胀，体温正常，没有出现体温升高的现象，山羊采食量没有明显变化，精神状况良好。

图1　分离菌在血液琼脂平板上形成的菌落

图2　革兰染色镜检结果

M.DNA标准DL 2 000; 1.空白对照；2.分离菌16 S rRNA 扩增片段M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2.16 S rRNA segment in sample

图3分离菌16 S rRNA PCR扩增电泳结果

Fig.3Electrophoresis of PCR products ofCorynebacteriumpseudotuberculosis16 S rRNA

3　讨论

细菌分离鉴定是及时确诊疾病的最直接证据，但是常规的细菌鉴定(生化实验、血清学试验)存在耗时费力等不足，应用分子生物学方法进行细菌16 S rRNA的克隆和序列分析，可以快速的进行细菌鉴定。

图4　分离菌16 S rRNA序列进化树分析

伪结核棒状杆菌进入动物体内后存在于动物细胞内，这使得治疗药物对伪结核病的疗效有限。本病主要经由脓包破溃后流出的脓汁接触健康羊的破损皮肤传播[7]。因此，治疗该病时，人们一般选择在脓包形成初期或者后期将其割除，并用双氧水冲洗创口或用民间偏方向割开脓包创口内填充红糖以期达到控制该病在羊群中传播目的[8-9]。本研究通过对不同羊场分离获得的1株分离株进行药敏试验得到了具有抑制分离菌生长的敏感药物，为这些羊场分离菌引起的疾病治疗提供参考。

疫苗免疫对伪结核病的防控能起到一定的作用[10]。本次试验在获得分离菌的基础上试制了伪结核棒状杆菌铝胶灭活自家疫苗，通过20 d的安全性试验，发现试制的疫苗副作用小，对山羊本身无明显影响，可以试用于健康羊群以观察对伪结核棒状杆菌感染的预防效果，为探索减少该菌对山羊的危害提供方法。本试验已经将试制自家疫苗应用到了采样场的健康羊群中，但由于该病在温热季节发病率较高，且注射羊群中有一些幼龄羊(幼龄动物发该病几率较小)，因此疫苗的效果还有待长期观察。

表1　伪结核棒状杆菌分离株药敏试验结果

参考文献：

[1]Mujgan I,Mehmet A,Ziya I,et al.Studies on vaccine development for ovine caseous lymphadenitis [J].Ankara Universitesi Veteriner fakultesi Dergisi,2010,57:161-165.

[2]杨雪红，郭雪洁，马宁君,等，羊干酪性淋巴结炎研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008(1):1-2.

[3]Trosit E,Ott L,Schneider J,et al.The complete genome sequence ofCorynebacteriumpseudotuberculosisFRC41 isolated from a 12-year-old girl with necrotizing lymphadenitis insights into gene regulatory networks contributing to virulence[J].BMC Genomics,2010,11:728.

[4]Oliveira M,Barroco C,Mottola C,et al.First report ofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrom caseous lymphadenitis lesions in black Alentejano pig[J].BMC Vet Res,2014,10:218.

[5]罗雯，万雅各.采用16 S rRNA基因PCR检测病原菌的研究进展[J].南昌大学学报：理科版，2000,24(3)：302-306.

[6]乔宏兴，索江华，边传周,等，鸡传染性鼻炎氢氧化铝佐剂灭活苗的制备及免疫试验[J].动物医学进展，2014,35(6)：157-159.[7]侯万天，刘界强.羊伪结核病的防治[J].畜牧与饲料科学，2014,35(9)：116-117.

[8]邢福珊，云世雄，李景河,等.波尔山羊干酪性淋巴结炎的病原鉴定及防治[J].上海畜牧兽医通讯，2004(5):48.

[9]廖雄，文正常，王璇,等.山羊伪结核 病的诊断与防治[J].中国畜禽种业，2013(9)：105-106.

[10]侯宏虎，王志芳，杨增岐.羊伪结核及大肠埃希菌病二联灭活油苗的试制[J].动物医学进展，2007,28(10)：116-118.

收稿日期：2016-01-21

基金项目：陕西省重点农业科技示范推广项目(ZDKJ-2014-33)；西北农林科技大学科技推广示范项目(Z222021411)

作者简介：蔡俊波(1987-)，男，重庆綦江人，助理畜牧师，兽医硕士，主要从事畜牧技术推广工作。*通讯作者

中图分类号:S855.12；S858.26

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0049-04

Isolation and Identification ofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrom White Goat in South Shaanxi and Development of an Inactivated Vaccine with Aluminum Hydroxide Adjuvant

CAI Jun-bo1,2,WANG Ai-ling1，LI Hai-min1,LI Chun-yan1,JIAO Yang-yang1,3,ZHANG Yan-ming1,GUO Kang-kang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;2.ComprehensiveAgriculturalServiceStationofHouliuTown,Shiquan,Shaanxi,725200,China;3.AnimalHusbandryandVeterinaryStationofZhenwudongtown,Ansai,Shaanxi,717400,China)

Abstract:Caseous lymphadenitis also known as ovine pseudotuberculosis,is a chronic zoonotic infectious disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis.This disease is harmful to goat especially,and there is not yet an effective treatment to prevent this disease.White goat is a main breed in Shiquan county of south Shaanxi,Corynebacterium pseudotuberculosis is an important pathogen in goat population and causes large economic losses in recent years.In order to screen drugs that are sensitive to local Corynebacterium pseudotuberculosis and develop an inactivated vaccine,the fresh pus were collected from the suspected pseudotuberculosis goats,the bacteria were isolated and identified from those samples.And then,drug sensitivity test was carried out with 1 isolate,and then an inactivated vaccine with aluminum hydroxide adjuvant was developed based this isolate.The results showed that the isolated bacteria formed a medium sized white,dry,flat and opaque,neat edge colony at solid agar,showing Gram stain positive.The isolate was confirmed as Corynebacterium pseudotuberculosis by analysis of 16 S rRNA sequences.Susceptibility test results showed this isolate was highly sensitive to ciprofloxacin,ceftriaxone,erythromycin,kanamycin,cefotaxime,moderately sensitive to tobramycin,doxycycline,gentamicin,chloramphenicol; tetracycline,rifampicin,streptomycin.Subsequently,an activated vaccine was developed with aluminum hydroxide adjuvant based on this isolate,no live bacterium was detected in this vaccine.The inactivated vaccine was injected to experimental goats in those herds that the samples were collected,and no abnormal reactions were observed in the goats.Clinical application also was carried out in goat herd and the immune effects will be evaluated later.This study provided an experimental basis for effective drugs and a choice of inactivated vaccine for preventing and controlling caseous lymphadenitis.

Key words:Corynebacterium pseudotuberculosis; isolation and identification; drug sensitivity test；inactivated vaccine