激素性股骨头坏死患者血清与坏死组织中受体活化因子配基的表达

李景龙

(安阳市人民医院骨科，河南　安阳　455002)



激素性股骨头坏死患者血清与坏死组织中受体活化因子配基的表达

李景龙

(安阳市人民医院骨科，河南安阳455002)

目的探讨激素性股骨头坏死(DNFH)患者血清Ⅰ前胶原氨基前肽(PINP)、Ⅰ型胶原C型肽(CTX)、骨钙素(OST)的表达与坏死组织中骨保护素(OPG)核因子(NF)-κB受体活化因子配基(RANKL)表达的相关性。方法2013年7月至2015年6月筛选99例激素性ONFH病人，手术中取得其骨髓组织，同期股骨颈骨折病人术中取得的骨髓组织49例作为对照。对标本骨髓组织采用贴壁法分离培养骨髓基质细胞，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测骨髓基质细胞OPG、RANKL表达水平，并计算OPG/RANKL比值。同时抽取两组病人外周静脉血检测血清PINP、CTX、OST表达水平。结果ONFH组与对照组比较，PINP、CTX、OST水平明显升高(P<0.05)；两组外周血血清PINP、CTX、OST水平与坏死组织中OPG、RANKL水平分别呈正相关(P<0.05)，与OPG/RANKL的比值呈负相关(P<0.05)。结论激素性ONFH时骨代谢活跃，与骨髓基质细胞OPGRANKL表达及比值有关。

糖皮质激素；股骨头坏死；骨髓基质细胞；核因子-κB

股骨头坏死(ONFH)的病因包括创伤性因素和非创伤性因素。前者的病因及发病机制十分明确，而非创伤性因素则较为复杂，最常见者包含糖皮质激素应用和酒精中毒两种〔1〕。骨保护素(OPG)和核因子-κB受体活化因子配基(RANKL)直接决定破骨细胞的分化与功能发挥，二者共同构成调节骨重建的横轴旁分泌系统〔2〕。OPG/RANKL系统在骨质疏松、骨肿瘤等疾病的发生和发展以及治疗方面均有较深入的研究，但在激素性ONFH中的研究较少。本研究旨在探讨激素性ONFH患者血清Ⅰ前胶原C型肽(PINP)、Ⅰ型胶原C型肽(CTX)、骨钙素(OST)的表达与坏死组织中ORG、RANKL表达的关联性。

1　材料与方法

1.1研究对象2013年7月至2015年6月进入某医院骨科就诊的ONFH患者99例。入组标准：①年龄≥18岁；②激素应用时间不低于1个月，或大剂量冲击使用激素时间超过1 w；③根据患者病史、症状、体征、影像学检查(X线平片、CT 或 磁共振检查)，诊断采用中华医学会骨科分会制定的《成人股骨头坏死诊疗标准专家共识(2012年版)》；④患者近半年内未服用过对骨代谢有影响的药品，包括抗惊厥药物、利尿药、钙制剂、D族维生素类似物、二膦酸盐类药物等。剔除标准：因减压病、酒精性、感染等其他因素所导致的致ONFH。ONFH组患者入院后均进一步完善相关化验检查，进行双侧髋关节磁共振检查、双侧髋关节CT扫描、拍摄骨盆平片，本研究采用1996年国际骨循环协会推荐的国际骨循环研究会(ARCO)分期方法进行分期。其中男65例，女34例；年龄35～75〔平均(56.3±6.7)〕岁。其中Ⅱ期23例(23.2%)，Ⅲ期29例(29.3%)，Ⅳ期47例(47.5%)；累及单侧股骨头41例(41.4%)，累及双侧58例(58.6%)。选择同期因股骨颈骨折入院患者49例作为对照组，男30例，女19例；年龄31～72〔平均(54.2±6.5)〕岁；病程1～7 d；均未接受激素治疗。

1.2方法

1.2.1主要实验设备CO2培养箱(美国Forma Scientific公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；电子天平(上海恒刚仪器仪表有限公司)；离心机(德国SIGMA)；倒置相差显微镜及数字照相系统(日本Nikon TE-2004)；光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；组织切片机(德国Leica公司)。

1.2.2实验取材对激素性ONFH进行髓芯减压治疗的患者，经由骨穿针及(或)刮匙吸取或刮取坏死股骨头的松质骨，对接受带血管骨瓣移植的患者及股骨头置换术的患者采集手术所取出股骨头的松质骨。所取组织经过肝素化后与等量无血清高糖DMEM培养液混匀、离心后收集沉淀细胞，进行骨髓基质细胞培养。至培养第8～10天后当骨髓基质细胞大约80%发生融合时，收集细胞，行酶联免疫吸附法(ELISA)检测测定RANKL和OPG水平，并计算比值。

1.2.3PINP、CTX、OST检测方法ONFH组于手术治疗前空腹6 h，经肘正中静脉抽取静脉血10 ml，加入含抗凝剂的真空采血管中充分混匀，采用全自动发光电化学法进行检测，并记录PINP、CTX、OST 的含量。

1.3统计学方法采用SPSS20.0软件进行t检验、χ2检验。

2　结　果

2.1两组外周血血清PINP、CTX、OST水平变化ONFH组外周血血清PINP、CTX、OST含量均明显高于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1　两组患者外周血清PINP、CTX、OST含量变化

2.2两组坏死组织中OPG、RANKL及OPG/RANKL变化ONFH组坏死组织中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2　两组坏死组织中OPG、RANKL含量及其比值的变化值)

2.3两组外周血血清PINP、CTX、OST水平与坏死组织中OPG、RANKL及OPG/RANKL的比值的关联两组外周血血清PINP水平与坏死组织中OPG、RANKL水平呈正相关(Pearson系数为0.869，R2=0.646，P<0.05)，与OPG/RANKL的比值呈负相关(Pearson系数为-0.288，R2=0.327，P<0.05)。CTX水平与坏死组织中OPG、RANKL水平呈正相关(Pearson系数为0.794，R2=0.514，P<0.05)，与OPG/RANKL的比值呈负相关(Pearson系数为-0.326，R2=0.89，P<0.05)。OXT水平与坏死组织中OPG、RANKL水平分别呈正相关(Pearson系数为0.856，R2=0.637，P<0.05)，与OPG/RANKL的比值呈负相关(Pearson系数为-0.421，R2=0.467，P<0.05)。

3　讨　论

ONFH后往往会伴随有新骨生成并逐渐替代坏死骨组织的骨代谢过程。有研究指出激素性ONFH病人血清中骨代谢标记物水平明显高于正常人群，主要包括PINP、CTX和OST，这表明病人在ONFH发生后其骨吸收和合成的速率均有所加快〔3〕。

大量研究显示，糖皮质激素可能是通过下调成骨细胞内Run相关转录因子(Runx)2、骨形态蛋白(BMP)2和OPG mRNA表达数量，抑制骨组织生成，大幅降低骨组织的修复能力，提升破骨细胞的活性，促进骨质吸收过程，引发并最终导致骨质疏松，骨密度降低，股骨头中的骨小梁发生微骨折，局部小梁间的微循环遭到破坏后发生中断，引发缺血性ONFH〔3～5〕。

间充质干细胞(MSCs)具有多向分化、免疫调节的特性，不仅能够归巢至损伤组织，抑制受损组织发生的免疫反应和过度炎性反应，MSCs还具有向多种组织、细胞分化的潜能，因此在创伤修复、组织功能再生与重建、免疫调节等领域应用前景广阔〔6〕。骨髓MSCs是骨髓中存在的多能干细胞，是成骨细胞的前体细胞，能够分泌很多种细胞因子，其中OPG和RANKL在骨代谢的调节过程中承担着非常重要的功能。通过检测骨髓MSCs中OPG和RANKL的表达水平，可以揭示骨骼新陈代谢的所处的状态，对疾病的转归做出准确的预判〔7〕。

此外，糖皮质激素也可通过上调RANKL。RANKL也称作OPGL，是位于破骨细胞表面的核因子-κB受体活化因子的配体，主要在成骨细胞与其前体细胞表达，经过旁分泌途径与破骨细胞的前体细胞及其破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子的配体进行结合，最终促使破骨细胞的形成及活化。OPG是由骨组织中的成骨细胞和骨髓基质细胞经合成、分泌而来，为RANKL的诱饵受体，能够竞争性结合PANKL，封闭并与之结合，阻遏破骨细胞的产生与活化，最终抑制破骨细胞产生的骨吸收过程〔7～9〕。

Ⅰ型胶原占人体胶原含量的首位，在矿化骨中属于唯一的胶原成分，在骨基质有机成分所占比例超过90%，由成骨细胞生产并释放出前胶原纤维，在细胞外分解产生PINP，因此PINP在血清中的水平能够反映成骨细胞合成释放骨胶原的能力，PINP可作为监测成骨细胞活性、成骨能力和骨形成速率的特异性生化指标。PINP目前已经广泛应用于恶性肿瘤发生骨转移的检测诊断当中〔10〕。本研究揭示出股骨头坏死所造成骨破坏刺激成骨细胞活性增强，修复遭到破坏的骨组织，造成PINP升高。

CTX作为I型胶原细胞外降价产物之一，与既往检测骨吸收的检验指标相比显著不同，CTX源自成熟的胶原纤维，在人体内无法被进一步降解和重新利用，因此通过CTX可以准确反映体内成熟胶原纤维的情况。在骨基质重建过程中，I型胶原大量分解并产生CTX，通过检测血清中CTX的水平即可准确地反映出骨吸收状态〔11〕。本研究揭示出ONFH所造成骨破坏刺激成熟的胶原纤维参与骨基质重建，造成CTX升高。

OST源于成骨细胞的合成并释放，其他组织器官无法产生OST，因此血清OST含量已被作为骨代谢转换的一个敏感指标，来检测代谢性骨病的骨转换率〔11〕。本研究揭示出ONFH骨组织矿化速度加快，造成OST升高。

1Corrado A,Neve A,Macchiarola A,etal.RANKL/OPG ratio and DKK-1 expression in primary osteoblastic cultures from osteoarthritic and osteoporotic subjects〔J〕.J Rheumatol,2013;40(5):684-94.

2Jiang C,Shang J,Li Z,etal.Lanthanum chloride attenuates osteoclast formation and function via the downregulation of rankl-Induced nf-κb and nfatc1 activities〔J〕.J Cell Physiol,2016;231(1):142-51.

3马小妮，葛宝华，陈克明，等.淫羊藿苷通过OPG/RANRL信号途经调节骨吸收的机理研究〔J〕.中国骨质疏松杂志，2013；19(1)：1-5.

4孙闯，逮代锋，周勇，等.淫羊藿苷对小鼠/骨溶斛膜型OPG/RANRL基因及其蛋白表达的影响〔J〕.现代生物医学进展，2012；12(34)：6647-50.

5王天胜,滕寿发,张英霞,等.骨髓基质干细胞移植在激素性股骨头坏死治疗中的作用机制研究〔J〕.临床和实验医学杂志,2015;14(1):10-2.

6沈水娟,李青华,何剑零,等.原发性肾病综合征患者核因子 KB 受体活化因子配体,护骨素及骨代谢标记物的变化〔C〕.浙江省肾脏病学术年会论文汇编,2014.

7李宁博.晚期激素性股骨头坏死股骨头骨组织中相关基因表达〔D〕.郑州：郑州大学,2014.

8孙云明.髓芯减压联合干细胞移植对股骨头坏死患者血清 PINP,CTX,OST 水平的影响〔J〕.中国老年学杂志,2015;35(14):3972-3.

9董松格.激素性股骨头坏死患者血清 PINP,CTX,OST 的变化及意义〔D〕.泰安：泰山医学院,2013.

10Boyce B F,Xing L.The RANKL/RANK/OPG pathway〔J〕.Curr Osteoporos Rep,2007;5(3):98-104.

11Sokos D,Everts V,Vries TJ.Role of periodontal ligament fibroblasts in osteoclastogenesis:a review〔J〕.J Periodontal Res,2015;50(2):152-9.

〔2015-12-31修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.087

李景龙(1978-)，男，主治医师，主要从事脊柱关节临床研究。

8681.8/8684.2

A

1005-9202(2016)14-3540-02；