miRNA-206 靶向细胞周期蛋白D2调控神经胶质瘤细胞增殖

黄佳佳　张官嫦　谭　娜　杨晓荣　张苏园　姚　晋　郑　洪

(遵义医学院附属医院病理科，贵州　遵义　563003)



miRNA-206 靶向细胞周期蛋白D2调控神经胶质瘤细胞增殖

黄佳佳张官嫦1谭娜杨晓荣张苏园姚晋郑洪

(遵义医学院附属医院病理科，贵州遵义563003)

目的探讨miRNA-206在神经胶质瘤组织中的表达及其对神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法采用荧光定量PCR方法检测神经胶质瘤组织和细胞系中miRNA-206 的表达情况；通过四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验检测miRNA-206对神经胶质瘤细胞T98G增殖的影响；生物信息学方法预测miRNA-206可能的靶基因，并采用荧光素酶报告基因实验验证预测的细胞周期蛋白D2(CCND2)是miRNA-206的靶基因；蛋白质印迹方法检测miRNA-206对CCND2表达的影响。结果miRNA-206在神经胶质瘤组织中的表达显著降低(P<0.01)，且神经胶质瘤恶性度越高，miRNA-206的表达越低(P<0.01)；同时，神经胶质瘤细胞系中miRNA-206的表达亦显著降低(P<0.01)；转染miRNA-206 mimics上调神经胶质瘤细胞T98G中miRNA-206表达后可显著抑制神经胶质瘤细胞T98G的增殖能力(P<0.01)，而转染anti-miRNA-206可增加神经胶质瘤细胞T98G的增殖能力(P<0.01)。通过TargetScan软件进行生物信息学预测显示CCND2为miRNA-206的功能性靶基因，且得到荧光素报告实验结果证实。蛋白质印迹结果显示转染miRNA-206可显著抑制神经胶质瘤细胞T98G中CCND2的表达。结论miRNA-206可通过调节CCND2的表达，进而抑制神经胶质瘤细胞T98G的增殖能力，神经胶质瘤组织中miRNA-206的低表达与神经胶质瘤的发生发展密切相关。

miRNA-206；神经胶质瘤；细胞周期蛋白D2

miRNA-206在多种肿瘤组织中存在异常表达，且与多种肿瘤的发生发展密切相关〔1,2〕。然而，关于miRNA-206在神经胶质瘤组织中的表达及其与神经胶质瘤发生发展的关系目前还很少有文献报道。本研究旨在探讨miRNA-206对细胞周期蛋白D2(CCND2)蛋白表达水平的影响及其调控神经胶质瘤进展的作用及相关机制。

1　材料与方法

1.1临床资料收集2012年1月至2014年1月于我院进行神经胶质瘤切除术的肿瘤及癌旁标本50例，均经病理证实为神经胶质瘤。年龄33～70〔平均(48.78±14.48)〕岁。根据WHO神经系统肿瘤分类标准进行病理分级。获取标本后迅速保存于液氮中。所有患者术前均未接受化疗和放疗。

1.2神经胶质瘤细胞系神经胶质瘤细胞系A172、U87MG、T98G、293ET和PC-3购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，均培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于37℃、5%CO2及饱和湿度的CO2孵箱中进行培养。待细胞生长至对数生长期开始实验。

1.3主要试剂胎牛血清购自Gibco公司；DMEM培养基购自Hyclone公司；转染试剂Lipofectamine2000、TRIzol、miRNA-206 mimics、阴性对照(NC)、anti-miRNA-NC和anti-miRNA-206购自Invitrogen公司，SYBR Green PCR试剂盒购自Roche公司；荧光素酶检测试剂盒购自碧云天公司；CCND2抗体购自Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗购自Santa Cruz公司。

1.4Trizol法的荧光定量PCR提取神经胶质瘤细胞总RNA，并反转录成cDNA。PCR反应条件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 50 s，共30个循环。引物序列：miR-206上游引物：5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，下游引物：5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；内参对照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。通过CT值法对得到的数据进行定量分析。

1.5细胞转染神经胶质瘤细胞传代至对数生长期并长至70%融合时开始进行转染实验。严格按照Lipofectamine2000试剂盒的说明书进行转染实验的相关操作，并在转染48 h后用于功能实验。

1.6四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)增殖实验实验用细胞培养至对数生长期，接种于96孔培养板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，37℃、5%CO2及饱和湿度条件下作用4 h后吸出上清，加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，低速震荡混匀10 min后，波长490 nm处测定OD值。

1.7生物信息学方法预测miRNA-206靶基因通过靶基因预测软件TargetScans筛选出CCND2作为miRNA-206的靶基因。

1.8荧光素酶报告基因验证靶基因Targetscan靶基因预测软件检测结果提示CCND2 mRNA的3'非翻译区(3'UTR)的1177-1183位点是miRNA-206的可能结合位点(BS)，体外合成含该位点的DNA片段及含该位点突变体的 DNA片段，克隆至双荧光素酶启动子载体pMIR，并共同转染至肺癌细胞中，培养48 h后，采用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.9Western印迹具体操作方法可参见文献报道〔3〕。至少重复3次所有实验。

1.10统计学方法应用SPSS16.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1miRNA-206在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达情况miRNA-206在神经胶质瘤组织中的表达较正常对照组织显著降低(P<0.01)，且神经胶质瘤恶性度越高，miRNA-206的表达越低(P<0.01)；miRNA-206在5种神经胶质瘤细胞系中的表达亦显著降低(P<0.01)。

2.2miRNA-206对神经胶质瘤细胞U87MG增殖的影响转染miRNA-206 mimics可显著抑制神经胶质瘤细胞U87MG的增殖能力(P<0.01)，而转染anti-miRNA-206可增加神经胶质瘤细胞U87MG的增殖能力(P<0.01)。见图1。

2.3TargetScan预测miRNA-206靶基因通过CCND2可能为miRNA-206的功能性靶基因。miRNA-206预测结合CCND2 3'-UTR的靶位点如图2所示。为确定miRNA-206是否和CCND2存在直接的相互作用，构建含野生型和突变型CCND2的3'-UTR序列的pMIR载体。结果显示，共转染野生型pMIR-CCND2 3'-UTR载体和miRNA-206的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，而共转染突变型pMIR-CCND2 3'-UTR载体和miRNA-206的荧光素酶活性未出现显著降低。

2.4miRNA-206对神经胶质瘤细胞T98G中CCND2表达的影响转染miRNA-206 mimics可显著抑制神经胶质瘤细胞U87MG中CCND2的表达，而转染miRNA-206抑制剂可增加神经胶质瘤细胞U87MG中CCND2的表达。见图3。

图1　miRNA-206对神经胶质瘤细胞T98G增殖影响检测

图2　TargetScans靶基因预测软件预测miRNA-206靶基因

图3　miRNA-206对神经胶质瘤细胞T98G中CCND2表达影响检测

3　讨　论

miRNA作为一类非编码小的RNAs，其长度约为19～25个核苷酸。近年来的相关文献研究的结果均证实miRNA对人类癌症的进展具有十分重要的作用〔3,4〕。Yunqiao等〔5〕证实miRNA-206在肝癌组织和细胞系中的表达均显著降低，过表达miRNA-206可抑制胃癌细胞系的增殖，并促进胃癌细胞系的凋亡；Chen等〔6〕研究结果同样证实miRNA-206具有抑制子宫内膜样腺癌细胞的增殖和侵袭能力。然而关于miRNA-206在神经胶质瘤进展中的作用及相关机制尚未研究清楚。本研究结果与上述研究结果一致。

miRNAs发挥作用主要通过下游的靶基因。G1细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物与哺乳动物细胞的细胞周期调控密切相关〔7〕，其过度表达会导致肿瘤的发生和发展。因此，在多种癌症中均存在CCND2水平的升高〔8,9〕，导致肿瘤细胞无限制的增殖，从而导致肿瘤的发生和发展。本研究结果提示可能是CCND2的表达被miRNA-206所调节而抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力。总之miRNA-206通过调控CCND2进而抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力。此外，在神经胶质瘤治疗中，miRNA-206可作为一种潜在的治疗靶点。

1Zhou J,Tian Y,Li J,etal.miR-206 is down-regulated in breast cancer and inhibits cell proliferation through the up-regulation of cyclinD2〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;433(2):207-12.

2Zhang L,Liu X,Jin H,etal.miR-206 inhibits gastric cancer proliferation in part by repressing cyclinD2〔J〕.Cancer Lett,2013;332(1):94-101.

3Zhang Y,Zheng D,Xiong Y,etal.miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally〔J〕.FEBS Lett,2014;588(10):1913-20.

4Hong L,Han Y,Yang J,etal.MicroRNAs in gastrointestinal cancer:prognostic significance and potential role in chemoresistance〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2014;14(8):1103-11.

5Yunqiao L,Vanke H,Jun X,etal.MicroRNA-206,down-regulated in hepatocellular carcinoma,suppresses cell proliferation and promotes apoptosis〔J〕.Hepato-gastroenterol,2014;61(133):1302-7.

6Chen X,Yan Q,Li S,etal.Expression of the tumor suppressor miR-206 is associated with cellular proliferative inhibition and impairs invasion in ERα-positive endometrioid adenocarcinoma〔J〕.Cancer Lett,2012;314(1):41-53.

7Kshaunis M,Subhabrata P,Rita K.Induction of apoptosis in G1/S blocked hela cells by r-roscovitine:a preliminary study〔J〕.Proceed Zoolog Soc,2014;67(2):114-25.

8Mermelshtein A,Gerson A,Walfisch S,etal.Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2005;93(3):338-45.

9Dong Q,Meng P,Wang T,etal.MicroRNA let-7a inhibits proliferation of human prostate cancer cells in vitro and in vivo by targeting E2F2 and CCND2〔J〕.PLoS One,2010;5(4):e10147.

〔2015-12-27修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.025

黄佳佳(1983-)，女，硕士，主治医师，主要从事分子病理研究。

R730.264

A

1005-9202(2016)14-3409-02；

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