脑钠肽及Smad蛋白调节的自发性高血压大鼠心肌纤维化及依那普利的干预作用

李日健　闫　海　柯伟良　黄瑞娜　吴　铿　李上海　游　琼

(广东医学院附属医院心血管内科，广东　湛江　524001)



脑钠肽及Smad蛋白调节的自发性高血压大鼠心肌纤维化及依那普利的干预作用

李日健闫海柯伟良黄瑞娜吴铿李上海游琼

(广东医学院附属医院心血管内科，广东湛江524001)

目的探讨脑钠肽(BNP)及骨形态发生蛋白(BMP)-2/Smad蛋白调节的自发性高血压大鼠心肌纤维化及依那普利的干预作用。方法雄性SD大鼠随机分为对照组、假手术组、高血压模型组、BMP-2拮抗剂noggin低、中、高剂量组和依那普利组(n=6)。采用在左心室游离壁5个点直接注入Ad5-HGF复制自发性高血压大鼠模型，noggin低(1 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高剂量组(25 mg/kg)和依那普利组(20 mg/kg)分别给予对应药物灌胃治疗30 d。分析各组大鼠血压变化，并检测心肌组织中基质金属蛋白酶(MMP)及其抑制剂蛋白(TIMP)、Ⅰ型胶原、α-平滑肌激动蛋白、羟脯氨酸、转化生长因子(TGF)-β和BNP及BMP-2/Smad蛋白水平变化。结果与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠血压、收缩压和舒张压明显升高(P<0.01)，且心肌组织中MMP-2、TIMP-1、MMP-9及羟脯氨酸、Ⅰ型胶原、α-平滑肌蛋白水平明显升高，Smad和BNP及BMP-2水平明显升高而TGF-β水平明显降低(P<0.01)，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。结论自发性高血压大鼠心肌组织发生明显的纤维化过程，且依那普利能通过调控BNP-Smad及MMP家族发挥改善作用。

自发性高血压；纤维化；依那普利；基质金属蛋白酶；羟脯氨酸

目前关于高血压所致的心肌组织重构和心肌纤维化过程的确切发病机制尚不明确。Smad蛋白是细胞内介导多种心血管疾病发生、发展的重要蛋白，也是药物治疗的可能的潜在靶点；基质金属蛋白酶(MMP)及其抑制剂是细胞外基质降解与组织重构的关键蛋白，也是组织纤维化进程的重要指标〔1〕。本研究拟分析脑钠肽(BNP)及骨形态发生蛋白(BMP)-2/Smad蛋白调节的自发性高血压大鼠心肌纤维化及依那普利的干预作用。

1　材料与方法

1.1动物及分组清洁级雄性SD大鼠购自广东医学院实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2003-0007，大鼠体重210～230 g。所有实验动物均在恒温(22℃±2℃)恒湿(55%±5%)条件下适应性饲养7 d，期间自由饮食。雄性SD大鼠随机分为对照组、假手术组、高血压模型组、BMP-2拮抗剂noggin低、中、高剂量组和依那普利组(n=6)。所有操作均符合本省实验动物管理条例的规定。

1.2模型复制大鼠适应性饲养1 w。除对照组和假手术组外，其余各组大鼠采用在左心室游离壁5个点直接注入转染人肝细胞生长因子腺病毒(Ad5-HGF)复制自发高血压大鼠模型，假手术组大鼠采取相同的操作，仅注入溶剂生理盐水而不注入Ad5-HGF。1 w后药物治疗组分别给予对应药物治疗：noggin低(1 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高剂量组(25 mg/kg)和依那普利组(20 mg/kg)分别给予对应药物灌胃治疗30 d，对照组、假手术组和模型组大鼠给予等剂量的溶剂羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃治疗30 d。

1.3检测指标造模结束后颈总动脉放血处死动物并分离血清，分离左心室后于液氮总保存，待用。本文分析各组大鼠造模前后及药物治疗前后血压变化，并检测心肌组织中基质金属蛋白酶及其抑制剂蛋白、I型胶原、α-平滑肌激动蛋白、羟脯氨酸、转化生长因子(TGF)-β和BNP及BMP-2/Smad蛋白水平变化。

1.4试剂总蛋白提取试剂盒及蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究中心；MMP-2及MMP-9蛋白检测试剂盒购自Omega公司；TIMP-1蛋白检测试剂盒购自R&D公司；TGF-β及BNP蛋白检测试剂盒购自BIOO公司；羟脯氨酸及Ⅰ型胶原蛋白检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；血管平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白检测试剂盒购自南京检测生物工程研究所；Samd蛋白检测试剂盒购自Abcam公司；BMP蛋白检测试剂盒购自Santa Cruz公司。所有操作过程均按照说明书进行。

1.5免疫印迹法各组大鼠心肌组织于0℃冰水浴中匀浆，并以等量总蛋白与5×上样缓冲液(1∶5)混合煮沸5 min后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯凝胶(SDS-PAGE)电泳。电泳完毕后剥离PAGE胶并进行半干法转硝酸纤维素膜膜2 h，然后将纤维素膜用5.0%胎牛血清白蛋白封闭1 h。磷酸缓冲液冲洗3次(每次10 min)后与第一抗体于4℃条件下孵育3 h；无菌磷酸缓冲液冲洗3次(每次10 min)，然后与第二抗体孵育3 h，无菌磷酸缓冲液冲洗3次(每次10 min)。然后进行显色、定影，并计算光密度。以β-actin作为内参。

1.6统计学方法采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、χ2检验。

2　结　果

2.1自发性高血压大鼠血压变化及依那普利的干预作用与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠血压、收缩压和舒张压明显升高，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。见表1。

表1　自发性高血压大鼠血压变化及依那普利的干预作用

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与假手术组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与低剂量组比较：5)P<0.05，6)P<0.01；与中剂量组比较：7)P<0.05；下表同，下图同

2.2自发性高血压大鼠MMP表达变化及依那普利的干预作用与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠心肌组织MMP-2、TIMP-1和MMP-9表达明显升高，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常表达的蛋白得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。见表2。

2.3自发性高血压大鼠TGF-β和BNP蛋白水平变化及依那普利的干预作用与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠心肌组织中BNP表达明显升高而TGF-β蛋白表达明显降低，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常表达的蛋白得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。见图1。

2.4自发性高血压大鼠羟脯氨酸及Ⅰ型胶原和α-平滑肌蛋白水平变化及依那普利的干预作用与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠心肌组织中羟脯氨酸及Ⅰ型胶原和α-平滑肌蛋白表达明显升高，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常表达的蛋白得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。见表3。

图1　自发性高血压大鼠TGF-β和BNP蛋白水平变化及依那普利的干预作用

组别MMP-2TIMP-1MMP-9对照组0.30±0.040.26±0.050.18±0.02假手术组0.29±0.020.26±0.060.19±0.04模型组0.68±0.102)4)0.70±0.122)4)0.55±0.112)4)低剂量组0.67±0.072)4)0.68±0.092)4)0.54±0.102)4)中剂量组0.62±0.111)3)5)0.57±0.131)3)5)0.48±0.052)4)5)高剂量组0.46±0.131)3)6)7)0.40±0.101)3)6)7)0.31±0.081)3)5)7)依那普利组0.45±0.091)3)6)7)0.42±0.071)3)6)7)0.33±0.071)3)6)7)

2.5自发性高血压大鼠BMP-2/Smad蛋白水平变化及依那普利的干预作用与对照组和假手术组相比，自发性高血压模型组大鼠心肌组织中BMP-2和Smad蛋白表达明显升高，而依那普利和BMP-2拮抗剂组上述异常表达的蛋白得到明显的改善(P<0.01)，且拮抗剂noggin作用具有剂量依从性效果(P<0.01)。见图2。

表3　自发性高血压大鼠羟脯氨酸及Ⅰ型胶原和α-平滑肌蛋白水平变化及依那普利的干预作用±s,n=6)

图2　自发性高血压大鼠BMP-2/Smad蛋白水平变化及依那普利的干预作用

3　讨　论

高血压导致的心血管重构是其威胁健康的重要方面，但是目前其发病机制尚不明确。本文提示自发性高血压大鼠心肌组织发生明显的纤维化过程，且依那普利能通过调控BNP-Smad及MMP家族发挥改善作用。

Smad蛋白是信号内信号转导通路的重要组分，其表达异常与多种心血管疾病的发生密切相关〔2〕。在研究佐剂性关节炎大鼠心肺功能损伤与TGF-β1/Smad2、4、7通路关系的研究中发现Smad蛋白表达异常参与了佐剂性关节炎大鼠心肺功能异常〔3〕。以往的研究也发现TGF-β1/Smad2信号通路参与了压力超负荷所致的大鼠心肌纤维化病理过程，而淫羊藿苷通过抑制该通路的过度活化减轻心肌纤维化过程〔4〕。以往的研究还证实肺心清胶囊能够改善大鼠肺纤维化症状，且此过程与其抑制细胞因子TGF-β1、Smad2/3的表达相关〔5〕，且四逆汤对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的改善作用也是通过调控Smad2和Smad7实现的〔6〕。本研究也表明该通路也参与了此模型中心肌纤维化过程，且依那普利能通过抑制该通路发挥治疗作用。MMP是细胞外基质降解与重构的关键酶，其也参与了多种组织的纤维化过程〔7〕。本研究也表明MMP及其抑制剂也参与了此模型中心肌纤维化过程，且依那普利能通过抑制其异常表达发挥治疗作用。

综上所述，自发性高血压大鼠心肌组织发生明显的纤维化过程，且依那普利能通过调控BNP-Smad及MMP家族发挥改善作用。

1冯寒，张城林，吴丹，等.CTRP3通过抑制Smad3通路和肌成纤维细胞转化减轻心肌梗死后心肌纤维化〔J〕.中国病理生理杂志，2015；31(10)：1793-5.

2丁雪峰，周京敏，朱凌倜，等.芪苈强心提取物阻断Smad3信号通路抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏成纤维细胞转分化〔J〕.中国分子心脏病学杂志，2014；14(6)：1144-8.

3黄传兵，万磊，刘健，等.佐剂性关节炎大鼠心肺功能损伤与TGF-β1/Smad2、4、7通路的关系〔J〕.安徽医科大学学报，2014；49(7)：901-5.

4张丽梅，杨竞，李意奇，等.淫羊藿苷抑制TGF-β1/Smad2信号通路改善压力超负荷所致的大鼠心肌纤维化〔J〕.中国药理学通报，2013；29(10)：1422-5.

5吕路艳，李青，宋精玲，等.肺心清胶囊对大鼠肺纤维化及其细胞因子TGF-β1、Smad2/3作用的实验研究〔J〕.临床肺科杂志，2012；17(4)：585-7.

6廖火城，刘勇，周彬，等.四逆汤对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化Smad2和Smad7的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2012；32(7)：934-8.

7巴图德力根，徐艳华，韩志强，等.德都红花-7味散对基质金属蛋白酶及转化生长因子β1在肝纤维化中表达的影响〔J〕.中国临床药理学杂志，2015；31(15)：1526-9.

〔2015-10-25修回〕

(编辑袁左鸣)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.014

湛江市非资助科技攻关计划项目(No.2013B01298)

李日健(1971-)，男，副主任医师，主要从事心脏起搏、冠脉介入治疗、顽固性心力衰竭诊治研究。

R541.3

A

1005-9202(2016)14-3381-03；