马兜铃酸作用下肾小管上皮细胞尾加压素Ⅱ、转化生长因子-β1的表达及相互关系

陈素贤　万义增　杨　悦　李敬岩　李　伦

(辽宁医学院附属第三医院病理科，辽宁　锦州　121000)



马兜铃酸作用下肾小管上皮细胞尾加压素Ⅱ、转化生长因子-β1的表达及相互关系

陈素贤万义增杨悦李敬岩李伦

(辽宁医学院附属第三医院病理科，辽宁锦州121000)

目的观察马兜铃酸(AA)作用下尾加压素(U)Ⅱ和转化生长因子(TGF)-β1在肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达及相互关系。方法常规培养的NRK-52E细胞分别加入DMEM培养基、AA、AA+ UⅡ、AA+ UⅡ+抗UⅡ抗体，培养24、36、48 h，用RT-PCR技术检测UⅡ、TGF-β1mRNA表达水平。结果与DMEM组比较，AA组NPK-52E细胞UⅡ和TGF-β1基因表达均明显增强(P<0.05)；与AA组比较，AA+ UⅡ组TGF-β1表达明显增强(P<0.01)；与AA+ UⅡ组比较，AA+ UⅡ+抗UⅡ抗体组TGF-β1基因表达显著降低(P<0.05，P<0.01)。结论AA作用下，NRK-52E细胞UⅡ和TGF-β1表达水平均升高，且UⅡ可诱导TGF-β1的表达，提示二者在AA肾病发生发展中可能有一定作用，且二者相互关联。

马兜铃酸；尾加压素Ⅱ；转化生长因子-β1

含马兜铃酸(AA)的药物主要在肾脏代谢，并且可以不断蓄积，且病变多为不可逆，成为许多老年患者肾衰竭的主要原因。尾加压素(U)Ⅱ是迄今发现的最强的体内缩血管活性物质，在肾脏尤其是近曲小管有丰富的表达。UⅡ及其受体mRNA在AA肾病的肾脏表达增强〔1〕。诸多研究表明，UⅡ在肾脏疾病中有一定作用。转化生长因子(TGF)-β1具有多种功能，在细胞的免疫调节、生长分化、损伤修复等方面发挥着重要作用。TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞转分化〔2〕。UⅡ与TGF-β1在肾脏疾病中均有重要作用，但二者在AA发病中有无作用、有无关系及关系如何尚未见报道。本研究从细胞水平探讨AA作用下二者的表达规律及其相互关系。

1　材料与方法

1.1材料马兜铃酸钠购自中国药品生物制品检定所。DMEM为Gibco公司产品。UⅡ及抗UⅡ抗体购自Sigma公司。 Trizol、逆转录酶AMV 、TaqDNA聚合酶等购自新西兰Invitrogen公司。肾小管上皮细胞NRK-52E由吉林大学药学院药理与毒理学教研室馈赠。

1.2细胞培养与处理常规培养的NRK-52E细胞，用胰酶消化(0.25%)，制成悬液，接种于12孔培养板，每组设6个复孔，细胞数1×104个/孔。贴壁培养24 h后，用含0.5%胎牛血清培养基培养，细胞同步后分别加入：单纯DMEM、AA(40 mg/L)、AA+ UⅡ(10-8mol/L)、AA+ UⅡ+抗UⅡ抗体(10-5mol/L)。继续培养24、36、48 h，收集细胞用于RT-PCR检测。

1.3指标检测RT-PCR检测细胞UⅡ和TGF-β1 mRNA的表达。UⅡ正义引物：5′-TGC CTG CTC TTC GTA GGA CT-3′，反义：5′-AGA GCC TTC CTC AAG CTT CC-3′，扩增产物242 bp。 TGF-β1正义引物：5′-GAC CTC AAT TGC GAG CTT TC-3′，反义：5′-AGT CCT CCT TCC GCC TTT AG-3′，扩增产物382 bp。内参GAPDH引物，正义：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，反义：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，扩增产物450 bp。提取细胞总RNA，总体积为25 μl。94℃变性5 min后，94℃变性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s。退火温度分别为：UⅡ为53℃，TGF-β1为59℃，GAPDH为55℃。经过30个循环，72℃再次延伸10 min。运用凝胶成像处理系统，对琼脂糖凝胶电泳结果进行灰度扫描，以GAPDH密度作为参考定量标准，UⅡ、TGF-β1的表达量以UⅡ、TGF-β1与GAPDH密度之比来表示。

1.4统计学处理采用SPSS13.0软件进行t检验。

2　结　果

2.1AA组UⅡ和TGF-β1基因表达与单纯DMEM培养基组比较，AA组NRK-52E细胞UⅡ基因表达在实验的3个时间段均明显增强(P<0.05)；TGF-β1 mRNA的表达在48 h明显增强(P<0.05)。见图1，表1。

2.2各组TGF-β1 mRNA表达见表2，图2。与AA组比较，AA+ UⅡ组TGF-β1 mRNA表达36 h、48 h明显升高(P<0.01)。与马兜铃酸钠+ UⅡ组比较，工+ UⅡ+抗UⅡ抗体组TGF-β1 mRNA表达36 h明显降低(P<0.05)，48 h显著降低(P<0.01)。

1：24 h DMEM组；2：24 h AA组；3：36 h DMEM组；4：36 h AA组；5：48 h DMEM组；6：48 h AA组图1　AA作用下大鼠NRK-52E细胞UⅡ和TGF-β1基因的表达

组别UⅡ24h36h48hTGF-β124h36h48hDMEM组0.49±0.120.55±0.090.62±0.070.32±0.060.37±0.080.39±0.08AA组0.64±0.091)0.75±0.101)0.78±0.101)0.44±0.040.47±0.030.58±0.031)

与DMEM组比较：1)P<0.05

表2　TGF-β1 mRNA在各组NRK-52E细胞中的表达

与AA组比较：1)P<0.01；与AA+UⅡ组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

3　讨　论

UⅡ最初作为一种血管活性肽被发现，随着对它研究的不断深入，UⅡ的非血流动力学作用被揭示：它不仅能促进细胞外基质表达、调节内分泌，还能促进肾小管上皮细胞的增殖〔3，4〕，激活大鼠肾小管上皮细胞的表皮生长因子受体〔5〕，抑制钾、钠的重吸收〔6〕，促进细胞内Ca2+的释放〔7〕，抑制NRK-52E细胞的凋亡〔8〕。总之，UII与肾脏及其疾病的病理生理学改变密切相关。

TGF-β1是一种多功能的细胞因子，它既可以促进ECM的积聚，使肾脏疾病向纤维化的方向发展，同时又是组织损伤、自身修复的重要成分，在多种疾病中发挥着重要作用。正常情况下，TGF-β1在近曲小管和集合管有表达。急性缺血性肾损伤时，新生NRK-52E细胞TGF-β1的表达及活性均明显增加，提示TGF-β1在肾小管再生中有重要作用。但在损伤修复后TGF-β1持续增加可使胶原沉积，导致肾的纤维化的发生。

糖尿病肾脏纤维化时UⅡ、TGF-β1表达均增强，二者很可能是通过自分泌和(或)旁分泌机制，在肾脏纤维化中发挥着重要作用〔8〕。Kemp等〔9〕发现，高剂量UⅡ可使肝细胞中TGF-β上升。Zhang等〔10〕发现TGF-β1参与UⅡ诱导的大鼠主动脉成纤维细胞的表型分化。本研究表明UⅡ与TGF-β1在AA肾病的发生发展中具有一定的作用，且UⅡ可诱导TGF-β1的表达，UⅡ的这种作用其中至少一部分是通过抗原-抗体途径来实现的，至于是否存在其他途径，还有待进一步研究。

1陈素贤，李才，于晓艳，等.尾加压素Ⅱ及其受体在急性肾损伤大鼠肾组织中的表达〔J〕.中国病理生理杂志，2011;27(7)：1406-8.

2曾红，周懿，姚国媛.转化生长因子诱导人肾小管上皮细胞转分化：Notch1受体阻断剂的影响〔J〕.中国组织工程研究，2014;18(51)：8261-8.

3陈素贤，李才，苗春生，等.尾加压素Ⅱ对大鼠肾小管上皮细胞的促丝裂作用〔J〕.吉林大学学报(医学版)，2007；33(2)：204-6.

4Sue YM，Chen CH，Hsu YH，etal.Urotensin Ⅱ induces transactivation of the epidermal growth factor receptor via transient oxidation of SHP-2 in the renal tubular cell line NRK-52E〔J〕.Growth Factors，2009；27(3)：155-62.

5Abdel-Razik AE，Forty EJ，Balment RJ，etal.Renal haemodynamic and tubular actions of urotensin Ⅱ in the rat〔J〕.J Endocrinol，2008；198(3)：617-24.

6Adebivi A.RGS2 regulates urotensin Ⅱ-induced intracellular Ca2+elevation and contraction in glomerular mesangial cells〔J〕.J Cell Physiol，2014；229(4)：502-11.

7Hsu YH，Chen TH，Chen YC，etal.Urotensin Ⅱ exerts antiapoptotic effect on NRK-52E cells through prostacyclin-mediated peroxisome proliferator-activated receptor alpha and Akt activation〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2013；381(1-2)：168-74.

8Tian L，Li C，Qi J，etal.Diabeles-induced upregulation of urotensin Ⅱ and its receptor plays an important role in TGF-beta 1-mediated renal fibrosis and dysfunction〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Melab，2008；295(5)：1234-42.

9Kemp W，Kompa A，Phrommintikul A，etal.Urotensin Ⅱ modulates hepatic fibrosis，and portal hemodynamic alterations in rats〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physol，2009；297(4)：762-7.

10Zhang YG，Hu YC，Mao YY，etal.Transforming growth factor-beta1 involved in urotensin Ⅱ-induced phenotypic differetiation of adventitial fibro blasts from rat aorta〔J〕.Chin Med J，2010;123(24)：3634-9.

〔2015-10-20修回〕

(编辑滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.013

辽宁省自然基金资助项目(No.2013022007)

万义增(1961-)，男，教授，硕士生导师，主要从事临床病理学研究。

陈素贤(1972-)，女，教授，硕士生导师，主要从事临床病理学研究。

R282

A

1005-9202(2016)14-3379-；