丹参内生拮抗细菌DS-9发酵条件的优化

常芳娟 ，赵劲宇，韩巨才，刘慧平

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)



丹参内生拮抗细菌DS-9发酵条件的优化

常芳娟 ，赵劲宇，韩巨才，刘慧平*

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的]从丹参体内分离到一株对番茄灰霉病菌有较好抑菌活性的内生细菌DS-9，为了更好地发挥其抑菌活性,[方法]通过单因素试验和正交试验方法对其培养基配方及发酵条件进行优化。[结果]最佳基础培养基为NYBD，碳源是葡萄糖，氮源是胰蛋白胨和牛肉膏的组合，最优培养条件为pH 9.0，装液量为200 mL/500 mL，接种量为10%，转速为130 r·min-1，时间为24 h，抑菌物质累积量最多，抑菌效果最好。[结论]通过该试验为今后丹参内生细菌生物制剂的开发应用提供理论依据。

关键词：菌体生长量；基础培养基；氮源；碳源；发酵条件

在其生活史的某一阶段或全部阶段生活在健康植物的各种组织和器官内，对植物组织没有引起明显病害症状的细菌，称为植物内生细菌[1,2]。植物内生细菌对被定殖植物有增进植物生长、生物固氮以及防病治病的作用，在一定程度上可以替代农药、化肥的使用，因此对植物内生细菌的开发是一项很有前途和意义的工程[3～5]。为了最大限度提高内生拮抗细菌抑菌活性物质的产量，降低工业化生产的成本，应对其发酵条件进行优化[6～8]。候美玲等对1株玉米内生枯草芽孢杆菌YY1进行发酵条件优化，在发酵培养30 h时，抗菌活性几乎增加至原来的2倍[9]。洪鹏等研究了解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensHF 01菌株发酵液对柑桔绿霉病菌PenicilliumdigitatumSacc的防治效果，优化培养基及培养条件后，所得发酵滤液处理柑橘果实4 d后，发病率由 56.7%降低到31.7%，病斑直径也由48.1 mm显著降低到25.9 mm，为其后期推广及产业化提供理论依据[10]。

菌株DS-9是自丹参体内分离到的一株拮抗细菌，前期试验表明其对多种植物病原菌均有不同程度的抑菌活性，为最大限度的提高菌株抗菌物质的产量，通过单因素试验和正交试验方法对菌株DS-9的培养基配方及发酵条件进行优化，为进一步提高活性物质的比率、降低生产成本，开发生物农药制剂奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株

丹参内生细菌DS-9和番茄灰霉病菌(Bortytiscinerea)均为山西农业大学农药学实验室分离、保存。

1.1.2培养基

NB培养基：蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏3 g，蒸馏水1 000 mL

LB培养基：酵母浸膏5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL

NYBD培养基：葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水1 000 mL

YSP培养基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，蒸馏水1 000 mL

CM培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1 000 mL

PDA培养基：琼脂粉20 g，马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL

上述培养基的pH用 1 mol·L-1HCl和 1 mol·L-1NaOH 调节在7.0～7.3之间。

1.1.3供试碳源

甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、乳糖。

1.1.4供试氮源

酵母膏和蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏、牛肉膏和酵母膏、胰蛋白胨和酵母膏、蛋白胨[11]。

1.2方法

1.2.1种子液的制备

用接种环，在酒精灯的外焰部位灼烧灭菌，挑起一环经活化培养48 h的DS-9菌株，将其接种在100 mL/250 mL的LB培养液中，放置于摇床中振荡，28 ℃，160 r·min-1培养24 h获得种子发酵液，备用。

1.2.2基础培养基的筛选

依照1.1.2的各种培养基灭菌后，进行接种， 接种量为1%(V/V),每个处理重复3次，在28 ℃,160 r·min-1下振荡培育72 h。之后，观察不同组分的培养基中DS-9菌液的生长状况，并测定各培养基中菌体生长量和抑菌物质的积累量。

1.2.3最佳碳源的筛选

将以上筛选出来的培养基作为基础培养基，分别用淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇代替基础培养基中的碳源，培养基灭菌后，进行接种， 接种量为1%(V/V),在28 ℃，160 r·min-1下振荡培养72 h。每个处理重复3次。测定菌体的生长量和抑菌物质的积累量。

1.2.4最佳氮源的筛选

根据以上步骤选出的适合DS-9生长的最佳碳源的培养基，将其中的氮源分别换成酵母膏和蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏、牛肉膏和酵母膏、胰蛋白胨和酵母膏、蛋白胨，培养基灭菌后，进行接种， 接种量为1%(V/V),在28 ℃，160 r·min-1下振荡培养72 h。每个处理重复3次。测定菌体的生长量和抑菌物质的积累量。

1.2.5菌体生长量的测定

在30 ℃下，将每次接菌后的培养基放入全能振荡器中进行黑暗振荡培养，使其菌株能充分发酵，提高其抗菌活性。用分光光度计测定其OD600值，以相对应的空白培养基为对照，每一个处理重复3次。

1.2.6培养条件的优化

试验采用正交法L16(45)(表1)，对丹参内生细菌DS-9进行发酵培养，并对pH，装液量，接种量，转速和发酵时间等条件进行优化，按照已筛选出的最佳培养基进行发酵，然后用1 mol·L-1NaOH和1 mol·L-1HCl调节培养液的pH，重复3次。

表1　培养条件的正交试验因素和水平

1.2.7抑菌物质积累量的测定

采用生长速率法，一定量发酵液在9 000 r·min-1,离心10 min，取发酵液上清1 mL与9 mL的PDA培养基充分混匀。冷却至40 ℃之后，接入直径为5 mm的番茄灰霉病菌，每个处理重复3次。用无菌发酵液作为对照。在25℃下恒温培养，待对照即将长满培养皿时，用十字交叉法测定处理组的病斑菌块直径/mm，并计算各处理的抑菌率[12～14]。

抑菌率/%=

2　结果与分析

2.1基础培养基筛选

在最适条件下培养72 h后，分别对发酵液的菌体生长量和抑菌物质积累量进行测定。通过分光光度计测定发酵液的OD600，结果见表2。不同组成成分的培养基，对内生细菌DS-9的菌体生长有显著影响：其中NYBD培养基中菌体生长量最大，OD600为2.585，其余菌体生长量的大小(OD600)依次为：2.081(LB培养基)、1.896(YSP培养基)、0.254(CM培养基)、0.217(NB培养基)。其中在以NYBD为培养基时抑菌物质产生量最多，而代谢物对番茄灰霉病菌生长抑制作用也最强，抑制率为71.16%。其余培养基中菌体代谢物对番茄灰霉病菌生长抑制作用的强弱程度依次为：68.92%(YSP培养基)、43.47%(LB培养基)、42.64%(CM培养基)和39.38%(NB培养基)。综合菌体生长量和抗菌物质积累量两个因素考虑，筛选出以NYBD培养基为基础培养基。

表2不同基础培养基中DS-9菌体的生长量和抑菌率

Table 2Basis different medium DS-9 bacteria growth and inhibition rate

基础培养基BasalmediumOD600值OD600抑菌率/%BacteriostasisrateYSP1.896±0.142b68.92±2.45aNYBD2.585±0.451a71.16±0.56aNB0.217±0.021c39.38±3.48bLB2.081±0.163b43.47±3.74bCM0.254±0.033c42.64±2.28b

2.2最佳碳源筛选

在最适条件下培养72 h之后，观察可发现在含有不同碳源的培养基中菌体的生长情况不同，发酵液在 24 h、 48 h、 72 h 的 菌体生长量(OD600)和抑菌物质的积累量如表3所示。菌体生长量方面，以葡萄糖作为碳源的培养基的 OD600在 24 h，48 h和72 h 分别为2.034、2.553、2.716，除在24 h略低于蔗糖和甘露醇外，在48 h和72 h均高于其余碳源菌体生长量。其中DS-9菌体的生长量在以葡萄糖为碳源的培养基中的代谢物对番茄灰霉病菌生长抑制作用最强，抑制率为74.47%。其余含有不同碳源的基础培养基中菌体代谢物对番茄灰霉病菌生长抑制作用差异不大，依次为：69.76%(甘露醇)、65.24%(麦芽糖)、64.41%(淀粉)、63.30%(乳糖)、62.42%(蔗糖)。结合菌体的生长量和抑菌物质的积累量2个方面考虑，选择葡萄糖作为DS-9的最佳碳源。

表3　不同碳源培养基中DS-9菌株的生长量与抑菌率

2.3最佳氮源筛选

在最适培养条件下，以筛选出来的葡萄糖为固定碳源，在不同氮源条件下，72 h发酵培养后，由表4数据可知：不同氮源培养基中DS-9菌体的OD600值和抑制率在同一氮源的无菌滤液中的生长量随着时间的推移在增加。胰蛋白胨和牛肉膏作为氮源时，菌体生长量最大，OD600为2.585，其余菌体生长量的大小(OD600)依次为：2.367(牛肉膏和酵母膏)、2.321(酵母膏和蛋白胨)2.286(牛肉膏和蛋白胨)、2.219(胰蛋白胨和酵母膏)、0.859(蛋白胨)。在抑菌物质积累量方面，以胰蛋白胨和牛肉膏为氮源的培养基中菌体的代谢物对番茄灰霉病菌抑制率为81.57%，明显高于其余5种氮源的78.48%(牛肉膏和酵母膏)、76.42%(酵母膏和蛋白胨)、75.54%(牛肉膏和蛋白胨)、68.73%(蛋白胨)、64.20%(胰蛋白胨和酵母膏)。综合菌体的生长量和抑菌物质的积累量两个方面考虑，选取胰蛋白胨+牛肉膏作为 DS-9的最佳氮源。

表4　不同氮源培养基中DS-9菌株的生长量与抑菌率

2.4培养条件的优化

通过表由极差分析可知(表5)，培养条件的5个因素最优水平组合为A4B4C4D2E1，即丹参内生细菌DS-9最优培养条件为pH为9，装液量为200 mL/500 mL，接种量为10%，转速为130 r·min-1，时间为24 h，所得抑菌物质累积量最多，抑菌效果最好。其中，由极差R值可知pH是影响菌株抗菌物质产生的主要因素，其次是发酵时间、装液量、接种量和转速。在实际培养中，确定丹参内生细菌培养条件最优组合，既要求主要因素一定要选择最优水平，又要求次要因素水平要综合考虑生产率，成本，劳动条件，从而得到最符合生产实际的最优条件。

3　结论与讨论

发酵是获得大量抗菌活性物质的基础，而抗菌活性物质的产量与培养条件，如碳源、氮源、pH以及培养时间等有着密切关系，为了能够更好的发挥内生菌的抑菌活性，并降低实际生产中的成本。通过试验可以发现，菌株的生长量越大，培养条件越适合，其培养液的抑菌率越大，即抑菌物质的积累也就越多。研究结果表明，内生细菌DS-9在NYBD为基础培养基，葡萄糖为固定碳源以及以胰蛋白胨和牛肉膏作为氮源的情况下，培养条件为pH为9，装液量为 200 mL，接种量为 10%，转速为130 r·min-1，时间为24 h时菌体生长量更好，分泌的抗菌物质也更多。这与臧超群[13]、刘旭[14]等的研究结果存在差异,这可能与菌株来源及宿主植物的生长环境有关。根据内生细菌独有的能和植物和谐共处这一特点，可以从生物源尤其是微生物和植物中，寻找出高效无污染的生物活性物质，是开发新型生物农药的一条重要途径。本试验筛选的丹参内生细菌DS-9对番茄灰霉病有较好的抑制效果，这对筛选新的生物农药用于病害防治有很好的应用前景。后续试验还将对丹参内生细菌DS-9的代谢产物的成分、抑菌机理以及大田防效进行更进一步的研究，以期生防菌DS-9更好的在田间发挥抑菌作用，并为以后工业化生产提供理论依据。

表5　最佳培养条件测定结果

注：主次顺序：pH(A)>时间(E)>装液量(B)>接种量(C)>转速(D)；优化组合：A4B4C4D2E1；k1,k2,k3,k4为在1,2,3,4水平下的抑菌率平均数，R表示极差；不同字母表示新复极差检验在0.05水平差异显著。

Note：Important order: pH(A)>Time(E)>Liquid medium volume(B)>Inoculum density(C)>Rotate speed(D)；Optimization: A4B4C4D2E1；k1, k2,k3, k4 for bacteriostatic rate averages at level 1, 2, 3, 4. R expresses range. Different letters mean significantly different at the level of 0.05 by Duncans test.

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(编辑：张贵森)

收稿日期：2016-03-16 修回日期：2016-04-09

作者简介：常芳娟(1991-)，女(汉)，山西晋城人，硕士，研究方向：农药毒理与生物农药 *通讯作者：刘慧平，教授，博士生导师。Tel:0354-6288679; E-mail:sxndlhp@163.com

基金项目：山西省财政支持农业科技成果转化项目(SCZZNCGZH201304);山西省财政支持农业科技成果转化资金项目(SCZZNCGZH201403)

中图分类号：S43

文献标识码：A

文章编号：1671-8151(2016)09-0649-05

Optimization of fermentation conditions of an endophytic antifungal bacteria DS-9 isolated from theSalviamiltiorrhiza

Chang Fangjuan, Zhao Jinyu, Han Jucai, Liu Huiping*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

Abstract:[Objective]The strain DS-9 was an endophyte bacteria from Salvia miltiorrhiza which can good control the Bortytis cinerea. To effectively inhibit pathogenic fungus, [Methods]Its medium composition and fermentation conditions were optimized by the method of single factor and orthogonal design. [Results]The results indicated that the best basic culture medium was NYBD, the optimum carbonsource was glucose, the nitrogen source was the combination of pancreatic peptone and beef extract, the optimum fermentation conditionswere as following: pH 9.0, shaking flask volume at 200 mL/500 mL, proper inoculation 10%, 130 r·min-1for 24 h, the antibacterial substance had higher yield and bacteriostatic effect was the best. [Conclusion]The test for the Salvia miltiorrhiza endophytic bacteria provides the theory basis for the development and application of biological agents.

Key words:Bacteria growth mass; Basal culture medium; Nitrogen source; Carbon source; Fermentation conditions