水杨酸对蛇龙珠葡萄白藜芦醇诱导合成的影响

丁玲，秦晨亮，代红军*（宁夏大学农学院/宁夏大学葡萄与葡萄酒教育部工程中心，银川 750021）



水杨酸对蛇龙珠葡萄白藜芦醇诱导合成的影响

丁玲，秦晨亮，代红军*
（宁夏大学农学院/宁夏大学葡萄与葡萄酒教育部工程中心，银川 750021）

摘 要：为了研究水杨酸（SA）对蛇龙珠葡萄白藜芦醇合成的影响，以蛇龙珠葡萄果实为试材，在浆果生长期设置0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的水杨酸处理，测定果皮和果籽中白藜芦醇的含量，并探讨白藜芦醇与苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（C4H）活性的关系。结果表明：在蛇龙珠葡萄发育过程中，果皮和果籽中的白藜芦醇含量出现2次高峰，分别出现在花后35 d和花后80 d；PAL和C4H活性的变化与白藜芦醇含量变化相似；不同质量浓度的水杨酸处理对蛇龙珠葡萄有明显的诱导效果，其中果皮中白藜芦醇含量以50 mg/L水杨酸诱导效果最佳，果籽中白藜芦醇含量以25 mg/L水杨酸诱导效果相关最佳。由此推断，适量的水杨酸处理能够激活PAL和C4H的活性，进一步提高白藜芦醇的含量。

关键词：水杨酸；蛇龙珠；白藜芦醇；PAL；C4H

白藜芦醇是植物对不良环境适应而产生的一种植物抗毒素［1］。正常情况下，白藜芦醇的合成很少，当环境恶化（如真菌感染、紫外线照射、植物生长胁迫剂的作用、机械损伤等）以及外源刺激时均会诱导白藜芦醇的合成［2-4］。研究发现，白藜芦醇来源于苯丙烷代谢途径，而在苯丙烷类代谢途径中有多种酶参与，而起关键性作用的是苯丙氨酸解氨酶（PAL）和肉桂酸-4-羟化酶（C4H）［5］。PAL是一种诱导酶，它能催化苯丙氨酸代谢途径的第一步反应，是初生代谢和苯丙烷类代谢途径的枢纽，可以受多种外界因素的诱导［6-7］；C4H催化苯丙氨酸途径的第二步反应，同时也是该途径的第一个氧化反应［8-9］，在植物生长发育过程中，如遭遇激发子、真菌感染、机械损伤及化学诱导，其编码基因mRNA积累水平的变化趋势与PAL趋于一致［10-11］。

水杨酸（Salicylic acid，SA）是植物界中广泛存在的一种小分子酚类物质，对植物生长发育过程中开花、侧芽萌发及性别分化等有重要的调节作用［12］，并已被确认为植物激素类的新成员。水杨酸不仅可调节植物的生长发育，还能诱导植物产生抗逆性，抵抗不良因素造成的伤害［13］。王定景等［14］研究表明，外源SA通过调节金线莲抗氧化酶系统能有效缓解高温胁迫对金线莲的伤害。申勋宇［15］研究表明，适当浓度水杨酸处理可以使冬枣保持较高的可溶性糖和VC含量，延缓冬枣的衰老进程。刘玲等［16］研究表明，外源喷施SA明显提高了库尔勒香梨的硬度和可滴定酸含量，降低了可溶性固形物的含量。目前对SA的研究主要集中在生理效应、植物体内的运转与分布以及一些作用机制，而对其提高葡萄白藜芦醇含量的研究较少。因此本试验以宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄蛇龙珠为试材，研究外源水杨酸处理对其果实在生长发育过程中白藜芦醇含量的影响，以期筛选出外源水杨酸最佳浓度，从而增加酿酒葡萄蛇龙珠白藜芦醇含量，对提高酿酒葡萄的经济价值具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料及地点

本试验于2014年在宁夏大学葡萄与葡萄酒教育部工程中心玉泉营基地进行，以5年生蛇龙珠为试材，选择生长健壮的植株，正常的水肥管理。冬季进行埋土防寒，采用倒“L”整形，株行距为0.5 m×3.0 m。单臂篱架栽培，每10～15 cm留1个结果枝，每个结果枝留1穗果。

1.2 试验设计

供试药剂设4个处理：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的水杨酸，并以清水处理作对照。每处理选取生长势基本一致的葡萄10株，在每株树的不同方位选择生长基本一致的10穗葡萄进行标记，试验设3次重复。

分别在花后10 d，以不同质量浓度的水杨酸喷施葡萄果穗，并以清水做对照。处理于2015年7月2日进行样品采集，以后每隔15 d采样1次，直至果实采收。每次采样时，均在标记的葡萄果穗上，选取不同着生方向的上、中、下部位采集果粒，放入冰盒后带回实验室，液氮冷冻，-80 ℃冰箱保存待用。

1.3 测定方法与指标

1.3.1 白藜芦醇的测定

参照陈建业［17］的方法，并加以改进。

将葡萄果实放入95 ℃的水中热烫30 s后取出，用手将果皮剥离，精确称取果皮1 g，放入研钵中，加入3 mL甲醇以及少许的石英砂进行研磨，到匀浆为止，再用3 mL甲醇转移到刻度试管中，在超声波条件提取30 min。然后在超低温离心机中离心（12 000 r/min，20 min）。将上清液取出，在40 ℃下进行旋转蒸发，干燥物用甲醇1 mL进行溶解，HPLC待测。在避光条件下进行全部的操作，从而防止白藜芦醇进行异构化。

高效液相色谱（HPLC）条件。色谱仪：安捷伦AGILENT1100型；色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；检测波长：306 nm；流动相：甲醇/水（40/60，v/v），等度洗脱，流速 1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量为20 μL，每一个样品进样之前，先用流动相进行15 min平衡。白藜芦醇采用外标法定量和标准品定性。白藜芦醇标准品购于上海源叶生物科技有限公司。

标准溶液的配制。先称5 mg白藜芦醇的标准品，放于50 mL容量瓶中，加入少量色谱甲醇溶解，定容到刻度，最后配制成浓度为100 mg/L的标准溶液作为储备液。分别取储备液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、16 mL置于100 mL的容量瓶中定容至刻度，从而得到浓度分别为1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L的标准溶液，以HPLC检测的相同滞留时间处的峰面积作为标曲纵坐标，以标样浓度为标曲的横坐标，进一步绘制标准曲线。

1.3.2 PAL的测定

参照金丽萍等［18］的方法。

分别称取果皮0.2 g和果籽0.2 g，研钵预冷，加入硼酸缓冲液2 mL（0.1 mol/L，pH8.8）和聚乙烯吡咯烷酮0.02 g，其中缓冲液中含有5 mmol/L巯基乙醇，l mmol/L EDTA。将样品冰浴研磨成匀浆，在4 ℃下10 000 r/min离心15 min，转移上清液至新的试管中即得到酶粗提取液。反应体系中包括2 mL硼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH8.8），0.8 mL L-苯丙氨酸（0.02 mol/L），0.1 mL酶粗提液，以不加酶液为对照，进而改加蒸馏水0.1 mL。在30 ℃条件下水浴30 min后，加入盐酸（6 mol/L）0.2 mL进行终止反应，于290 nm处测吸光值。按以下公式来计算酶的比活力。

酶的比活力：0.01△A/（mg·h）=△A×D/0.01×M×T，其中：△A为在一定时间内吸光度的变化；M为样品鲜质量；T为反应时间；D为反应液的稀释倍数，即所提取的总酶液为反应酶液的倍数。

1.3.3 C4H的测定

参照Lamb等［19］的方法。

分别称取果皮0.2 g和果籽0.2 g，加入预冷的5 mL提取液，该提取液包括 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6）和5 mmol/L巯基乙醇，加入石英砂和少量的PVP，将研钵放在冰上，进行研磨至匀浆，于超低温离心机中10 000 r/min离心20 min，转移上清液至试管中测定酶活性。反应液组为：2.2 mL的0.05 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.6，含反式肉桂2 μM，NADPNa22 μM，G-6-P-Na25 μM），在反应液反应开始前用25 ℃预温5 min后，加0.8 mL酶液即开始反应。25 ℃反应30 min，加0.1 mL 6 mol/L HCl终止反应，10 000 r/min离心10 min，取上清液在340 nm下比色。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2007和DPS 7.5软件进行统计分析，邓肯氏法进行了多重比较。不同的小写字母表示差异的显著性。

2 结果分析

2.1 蛇龙珠葡萄生长发育过程中白藜芦醇含量的变化规律

由图1可知，蛇龙珠葡萄果皮和果籽在发育过程中，白藜芦醇含量呈双峰型变化，在花后35 d和花后80 d出现峰值。果皮在花后50 d白藜芦醇含量最低，进入成熟期后（花后95 d）其含量呈下降趋势。果籽白藜芦醇含量最低值出现在花后65 d，进入成熟期后，白藜芦醇也呈现下降趋势。从整体来看，蛇龙珠葡萄果皮中白藜芦醇含量高于果籽。

图1 蛇龙珠果实发育过程中白藜芦醇含量变化

2.2 水杨酸对蛇龙珠葡萄白藜芦醇含量的影响

图2 水杨酸处理对蛇龙珠葡萄果皮（A）、果籽（B）白藜芦醇含量的影响

由图2可知，水杨酸处理蛇龙珠葡萄后，能够改变其白藜芦醇的含量，但未改变其变化趋势。蛇龙珠葡萄果皮和果籽中白藜芦醇含量变化在花后80 d达到最大值，之后开始下降。在花后35 d出现一个小高峰，低于花后80 d。其中，50 mg/L 和100 mg/L的水杨酸处理蛇龙珠葡萄后，在花后80 d果皮中白藜芦醇含量分别达到14.09 μg/g和13.43 μg/g，与对照相比，分别提高了45%和39%。另外，果皮中白藜芦醇含量除了在花后80 d时水杨酸处理对其影响比较显著之外，还在花后50 d时，25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L的水杨酸处理使得蛇龙珠葡萄果皮中白藜芦醇含量相对于对照组依次显著提高了57%、48%和33%，除去花后50 d和80 d之外的时期，水杨酸对蛇龙珠葡萄果皮中白藜芦醇含量的影响几乎不显著。与果皮不同，经25 mg/L的水杨酸处理后，花后80 d果籽中白藜芦醇含量达到最大值为11.59 μg/g，与对照相比，显著地提高了84%；而在花后50 d和65 d时也极显著地提高了65%和104%，其它时期各组之间的差异不太显著。

2.3 水杨酸对蛇龙珠葡萄中PAL活性的影响

由图3可知，蛇龙珠葡萄经水杨酸处理后，PAL活性的变化和白藜芦醇含量变化大致相同。与对照相比，经水杨酸处理蛇龙珠葡萄后，果皮和果籽中PAL活性明显提高，但未改变其变化趋势，其中，在经过花后35 d的一个小高峰之后，在花后50 d时PAL活性都出现一个低值，分别为3.59 U/（mg·h）和2.31 U/（mg·h）；并在花后80 d，果皮和果籽中PAL活性分别达到最大值为22.18 U/（mg·h）和22.43 U/（mg·h），相对于对照组，分别提高了27%和16%，各处理组与对照组的PAL活性差异显著。

图3 水杨酸处理对蛇龙珠葡萄果皮（A）、果籽（B）PAL活性的影响

2.4 水杨酸处理对蛇龙珠葡萄中C4H活性的影响

由图4可知，蛇龙珠果皮C4H活性呈双峰型变化，在花后80 d达到最大峰值，且3个浓度处理的C4H活性相差不大，其中经100 mg/L水杨酸处理使果皮中C4H活性在花后80 d达到最大值8.73 U/（mg·h）；与对照相比，C4H活性提高了55%，之后成下降趋势。果籽C4H活性的变化与果皮不同，在花后35 d呈现一个最低值0.44 U/（mg·h），之后随着果实的发育，呈上升趋势，达到最大值2.67 U/（mg·h）；相对于对照组，100 mg/L水杨酸处理使得C4H活性提高了101%，但100 mg/L的水杨酸处理使得果籽C4H活性变化幅度太大，不够稳定，而25 mg/L水杨酸处理使得果籽中C4H活性稳定增加，尤其在花后50 d，进入成熟期后，25 mg/L水杨酸处理组的C4H活性趋于稳定。

3 讨论与结论

李婷等［20］对不同品种葡萄不同部位的白藜芦醇含量进行了测定和比较，结果表明：不同组织部位白藜芦醇含量差异较大，其含量由高到低的顺序为果皮＞种籽＞叶柄。本研究结果表明：蛇龙珠葡萄果实中不同部位白藜芦醇含量由高到低的顺序为果皮＞果籽，这与李婷等人的研究结果相一致。

图4 水杨酸处理对蛇龙珠葡萄果皮（A）、果籽（B）C4H活性的影响

本实验研究发现，果皮中白藜芦醇含量的变化出现2个高峰，而在葡萄生长发育的过程中，果籽内白藜芦醇含量仅出现1个高峰，即在果实膨大时期，之后一直处于下降趋势，这可能与葡萄转色有关；进一步从苯丙烷代谢途径分析发现，果皮和果籽中PAL和C4H活性变化曲线也呈双峰型变化，这与陈建业［17］的研究相一致。

研究还可以看出，果皮中的白藜芦醇含量随着果实生长发育过程呈现先增长后下降再增长的双峰变化趋势，且花后80 d其含量高于花后35 d。这是因为花后20 d果实处于绿果期，各种化合物正在缓慢地合成，白藜芦醇含量也在缓慢地增加，花后35 d出现第一个高峰；而后果实开始膨大，需要消耗之前积累的化合物，因此白藜芦醇含量有所下降；花后50 d，随着果实进入糖分快速积累阶段，白藜芦醇含量先缓慢升高；花后65 d伴随着果实转色，此时果实中的白藜芦醇含量快速升高；在花后80 d白藜芦醇含量达到最高峰。随着葡萄发育进入成熟阶段白藜芦醇含量逐渐下降，在盛花后95 d果皮中白藜芦醇含量降到最低。

研究表明，白藜芦醇在自然条件下合成较少，经外源刺激可以大量合成，因此可以采取人工诱导的方法来提高白藜芦醇的含量。本研究表明，经不同浓度水杨酸处理蛇龙珠葡萄后，能够明显提高PAL和C4H的活性，因而进一步增加白藜芦醇的含量，且诱导果皮和果籽白藜芦醇含量较适的水杨酸浓度为50 mg/L和25 mg/L。

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中图分类号：S663.1

文献标识码：A

DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2016.04.004

收稿日期：2016-05-04

基金项目：国家自然科学基金（31260456）

作者简介：丁玲（1991-），女（回族），在读硕士研究生，研究方向为葡萄栽培生理。E-mail: 1063059804@qq.com

*通讯作者：代红军（1967-），女（汉族），教授，硕士生导师，主要从事葡萄栽培生理研究。E-mail: dai_hj@nxu.edu.cn

Effects of salicylic acid on induction of resveratrol synthesis in Cabernet Gernischt grapes

DING Ling ， QIN Chenliang， DAI Hongjun*
（School of Agronomy， Ningxia Univercity； Engineering Research Center of Grape and Wine，Ministry of Education of China，Ningxia University， Yinchuan 750021）

Abstract:The different concentrations （0， 25， 50， 100 mg/L） of salicylic acid （SA） were conducted on the Cabernet Gernischt grapes during the beeries growth periods， the content of resveratrol of skins and seeds were determined to investigate the effects of salicylic acid on induction of resveratrol synthesis， and to discuss the relationship between resveratrol and the activities of phenylalanineammonia-lyase （PAL）， cinnamate-4-hydroxylase （C4H）in Cabernet Gernischt grapes.The results indicated that the content of resveratrol in the skins and seeds of the Cabernet Gernischt grapes had two peaks at 35 days and 80 days after anthesis.The activity of PAL and C4H were similar to the change of resveratrol content.There was an significant effects on Cabernet Gernischt with different concentration of SA treatments， among which 50 mg/L SA treatment had the best induction effect in the skins and 25 mg/L SA treatment had done best in the seeds.Therefore， the moderate concentration of SA treatment could induce the activity of PAL and C4H and further enhance the content of resveratrol.

Key words:salicylic acid； Cabernet Gernischt； resveratrol； PAL； C4H