清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠生化指标和肝组织病理学的影响*

王一强，张玉香，姜德民，史晓伟

(1.甘肃省中医学校，甘肃 兰州 730050； 2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)



清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠生化指标和肝组织病理学的影响*

王一强1，张玉香1，姜德民1，史晓伟2

(1.甘肃省中医学校，甘肃 兰州 730050； 2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050)

目的：观察清肝祛湿活血方对非酒精性脂肪肝大鼠总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等生化指标和肝脏组织病理学结果的影响。方法: 通过高脂饮食诱导非酒精性大鼠脂肪肝模型, 随机分为正常对照组、模型对照组、多烯磷脂酰胆碱组、清肝祛湿活血方低、中、高剂量组，60 d后开始取材，检测大鼠CHOL、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C等生化指标和肝脏组织病理学结果。结果:与模型对照组对比,清肝祛湿活血方高、中、低剂量组血清CHOL、TG、LDL-C水平和ALT、AST活性均降低，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，HDL-C升高，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；所有给药组大鼠肝脏脂肪变性程度均获改善,其中清肝祛湿活血方高剂量组效果明显。结论:清肝祛湿活血方可有效减少非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂肪堆积、调节血脂、改善肝功能。

清肝祛湿活血方/药效学；非酒精性脂肪肝；动物模型；生化指标；肝组织

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史的肝实质细胞脂肪变性和储存为特征的临床病理综合征[1],目前已成为主要慢性肝病之一，是肝硬化、肝癌等疾病的诱因，同时与代谢疾病及心脑血管事件关系密切。目前尚无被医学界公认的治疗NAFLD的药物，所用药物只是针对其发病原因和病理机制进行治疗。清肝祛湿活血方由夏枯草、密蒙花、青葙子、茵陈、垂盆草、丹参、郁金7味中药组成。本研究采用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，观察清肝祛湿活血方对其总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)等生化指标的影响，以及模型大鼠肝脏组织学改变情况，以探讨清肝祛湿活血方治疗NAFLD的机制，为该方临床治疗NAFLD提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物

选取同批雄性SD大鼠90只，清洁级，体质量(150±20)g，购自甘肃中医学院实验动物中心，生产许可证号: SYXK(甘)2011-0001。实验前将动物置于实验室1周以适应环境，室温控制在 18～20 ℃，标准饲料进行喂养，进食自由，饮用水为自来水。

1.2药品、试剂与仪器

清肝祛湿活血方药物组成：夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陈10 g，垂盆草10 g，丹参15 g，郁金10 g。中药煎剂由甘肃中医学院药学实验室制备。多烯磷脂酰胆碱胶囊，商品名为易善复，北京安万特制药有限公司产品，批号5JD007。 大鼠CHOL(批号402012A)、TG(批号401181A)、HDL-C)(批号402063A)、LDL-C(批号404011C)、ALT(批号402221A)、AST(批号403113B)检测试剂盒均购自上海酶联生物研究所。TOSHIBATBA-120FR全自动生化分析仪，日本东芝公司产品；OHAUS1/1000型电子天平，美国BECKANCOULTER公司产品；HH-S型数显恒温水浴箱，江苏省金坛市医疗仪器厂产品；5417R低温高速离心机，德国EPPENDORF公司产品；TC-120智能程控生物组织自动脱水机，湖北省孝感市泰维电子设备有限公司生产。

1.3动物分组与模型的建立

将90只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组，模型对照组，多烯磷脂酰胆碱组，清肝祛湿活血方低、中、高剂量组6组，每组15只。常规饲养7 d 后，正常对照组给予普通饲料喂养60 d；其余各组按照聂文山等[2]的造模方法，予高脂饲料(84%基础饲料+10%猪油+5%蛋黄粉+1%胆固醇)，并于制模后1周腹腔注射四环素150 μg/g，以后每6天腹腔注射1次四环素100 μg/g，共计6次，并于实验前(0 d)和制模后6，12，18，24，30 d测量体质量，并根据体质量调整给药量，第30天造模成功(已经通过预实验，病理切片显示此造模方法成功)。

1.4给药方法

造模结束后，即实验第31天开始，治疗组给予清肝祛湿活血方进行灌胃治疗。人与大鼠剂量的换算参照《药理实验方法学》[3]，采用中剂量给药，大鼠用药量是成人剂量的9倍。换算出大鼠的对应给药量为11.25 g生药/kg。清肝祛湿活血方低、中、高剂量组依次给予5.63，11.25，22.50 g生药/kg，多烯磷脂酰胆碱组参照文献[4]给予550 μg/(g·d)。使用时，按照大鼠灌药容积20 μL/g计算，用蒸馏水将清肝祛湿活血方煎剂配成小剂量组0.28 g/mL、中剂量组0.56 g/mL、大剂量组1.13g/mL，造模成功后大鼠平均体质量按200 g/只计算，干预组每只大鼠每次灌胃4 mL， 1 d 1次。正常对照组与模型对照组分别给予蒸馏水代替，灌胃量每天4 mL，1 d 1次。各组连续给药30 d。实验过程中观察比较各组大鼠的一般情况。

1.5检测指标

1.5.1血清生化指标

沿大鼠腹中线迅速剪开腹腔，用10 mL注射器无菌采取腹主动脉血8 mL，常规分离血清，-20 ℃冻存备测。严格按照试剂盒说明书测定CHOL、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C活性。

1.5.2肝脏组织学观察

各组大鼠15只，留取肝左叶同一部位新鲜肝组织，清洗后置于100 g/L 中性甲醛固定，送病理检查作组织切片。肝细胞脂肪变性程度判断标准[4]:以肝小叶内未见脂滴肝细胞为阴性，脂滴肝细胞占肝细胞总数<1/3为+1，1/3～2/3为+2，>2/3为+3，几乎均呈脂滴肝细胞为+4。

1.6统计学方法

2　结　果

2.1各组大鼠CHOL、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和AST对比

与正常对照组对比，模型对照组CHOL、TG、HDL-C、LDL-C 、ALT、AST含量升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，多烯磷脂酰胆碱组及清肝祛湿活血方各剂量组CHOL、TG、LDL-C、ALT、AST均降低,差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；多烯磷脂酰胆碱组HDL-C无明显改变，清肝祛湿活血方各剂量组均有所升高，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。与多烯磷脂酰胆碱组对比，清肝祛湿活血方各剂量组CHOL、TG、LDL-C、ALT、AST含量均有降低(P<0.01或P<0.05)，尤以高剂量组中各指标含量降低最为显著(P<0.01)，清肝祛湿活血方各剂量组HDL-C均升高，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。

分 组CHOL/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)正常对照组1.42±0.14 0.88±0.170.90±0.160.32±0.0530.25±4.8148.2±8.3模型对照组2.65±0.50**1.38±0.42**0.65±0.07**1.05±0.33**87.42±15.3**285.3±16.9**多烯磷脂酰胆碱组1.89±0.39*#0.56±0.22*#0.64±0.06*0.54±0.17*#50.18±3.1*##177.3±18.8*##低剂量组1.54±0.15*#△0.52±0.27*#△0.70±0.08*#△0.40±0.18*#△65.26±5.2*#△225.14±14.1*#△中剂量组1.37±0.13*#△0.42±0.23*#△0.72±0.19*#△0.31±0.06*#△60.15±3.3*#△197.3±11.5*#△高剂量组1.21±0.19*##△△0.34±0.21*##△△0.79±0.16*#△0.24±0.08*##△△53.22±2.8*##△168.2±16.1*##△

注：与正常对照组对比:*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组对比:#P<0.05，##P<0.01；与多烯磷脂酰胆碱组对比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2各组大鼠肝脏组织病理学对比

2.2.1肉眼观察

正常对照组大鼠腹腔中无明显脂肪组织增生,肝脏体积正常，呈红色。模型对照组大鼠腹腔肥大，肝体积增大明显，脂肪组织丰富，呈砖红色，切面油腻感。各治疗组与模型对照组对比，大鼠腹腔脂肪组织含量减少，肝脏体积较之偏大，呈暗红色且部分切面有油腻感。

2.2.2光镜下HE染色

正常对照组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝细胞沿肝窦呈放射状,排列整齐,肝细胞大小较一致,核结构清晰无异常；模型对照组大鼠肝组织可见肝细胞重度弥漫性大泡性脂肪变；各治疗组大鼠轻、中度肝细胞大泡性脂肪变。正常对照组大鼠肝脏无明显炎症改变；模型对照组肝脏炎症明显,多数肝细胞胖胀,小叶内可见部分坏死性,炎性细胞浸润至汇管区,可见大量炎性细胞聚集；各治疗组大鼠肝细胞少数气球样变,偶可见小叶内有坏死姓,可见轻度炎性细胞浸润于汇管区,部分有炎性细胞聚集，较模型对照组减轻。

3　讨　论

中医学中并无非酒精性脂肪肝的病名，根据其相关临床表现，将其归属为“积聚”“胁痛”“肝著”“黄疸”“痰证”“脂满”等范畴。有关NAFLD的病因病机，学者们依据本病的表现及相关理论，结合自己的临床经验提出了诸多观点。谭远忠等[5]认为：本病多因饮食引起，过度食用肥甘厚腻及辛辣刺激之品，导致体内生痰湿之邪，邪气阻滞中焦导致脾失健运，肝失疏泄，湿浊内蕴，瘀血阻滞，进而导致痰瘀互结，肝脏脉络受到痹阻，形成脂肪肝。迟蕾等[6]认为：本病的发病原因是由于肝郁气滞、脾肾两虚，病机是本虚而标实、痰瘀互结，肝脉受损。赵文霞等[7]认为：本病由于久病体虚、饮食失调、情志不畅所致，病理因素为气滞血瘀、痰湿蕴结，病位主要在肝，与肾、脾、胃等脏腑关系密切。病机为气血阻滞、痰湿蕴结，从而影响了肝脏的主要生理功能，日久闭阻肝络而发病。刘平等[8]认为：本病是以邪实为主，湿浊内生为始动因素，湿热蕴于血分是其基本病机。马晓燕等[9]认为：脾肾气虚是疾病的发病基础，湿浊内蕴是主要的病理因素，气虚毒蕴为主要病理机制，本虚标实是其病机特点。笔者通过多年临床观察发现，NAFLD患者除具有气滞血瘀、脾虚湿盛外的表现外，还兼有肝火旺盛的特点。

清肝祛湿活血方由夏枯草、密蒙花、青葙子、茵陈、垂盆草、丹参、郁金组成。方中夏枯草为清肝火、散郁结的要药，给予重用；密蒙花配以青葙子治疗肝经之实热且润肝燥；茵陈具有清热利湿、退黄的功效，临床上主要治疗黄疸、小便不利、湿疮瘙痒等疾病，具有利胆、保护肝功能的作用；垂盆草有清热解毒、清利湿热作用，可降低谷丙转氨酶；配以丹参、郁金活血通络，疏肝经之瘀，行肝中之结。全方共奏清肝祛湿、活血化瘀之效[10-11]。

本研究表明:清肝祛湿活血方可减少非酒精性脂肪肝大鼠肝脏脂肪堆积、调节血脂、改善肝功能，对非酒精性脂肪肝有一定的治疗效果。

[1]TAKAHASHI Y,SUGIMOTO K,INUI H，et al.Current pharmacological therapies for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis[J].World J Gastroenterol,2015,21(13):3777-3785.

[2]聂山文，赵文霞，石艳芬，等.高脂饲料联合四环素腹腔注射复制非酒精性脂肪肝大鼠模型的实验研究[J].中国中西医结合急救杂志，2013,20(6)：374-375.

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(编辑陶珠)

2016-02-24；修回日期：2016-05-11

1001-6910(2016)07-0059-03

R575.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.07.29

甘肃省中医药管理局2015年课题资助项目(GZK-2015-7)

·实验研究·