纤维蛋白胶应用于犬自体网状皮片移植效果的观察

亢心，陈智华*，郭慧琳，范希萍，高宇航，年聚盆，韩鹏

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046)



纤维蛋白胶应用于犬自体网状皮片移植效果的观察

亢心1，陈智华1*，郭慧琳2，范希萍1，高宇航1，年聚盆1，韩鹏1

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730046)

为探究纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)应用于犬自体网状皮片移植术中的效果，选取15只犬作为试验动物，于两前肢建立3 cm×4 cm的全层皮肤缺损模型，以胸背部作为供皮区，将纤维蛋白胶应用于网状皮片移植术中，以单纯网状皮片移植为对照，于术后第3、5、7、14、28天随机选取3只进行大体观察和移植皮片局部观察，并制备石蜡切片进行组织学观察。皮片局部观察结果显示，试验组红肿、渗出较对照组轻微，炎性反应期短；术后28 d，所有皮片生长良好，试验组线性瘢痕较对照组轻。组织学观察结果显示，试验组较对照组炎性细胞的浸润期短，胶原纤维排列规则，皮肤附属结构完整。结果表明，纤维蛋白胶可缩短创面炎性反应期，增强局部组织修复能力，减少瘢痕的过度增生，可使成活后的移植皮片结构和功能更接近正常皮肤。

犬；纤维蛋白胶；网状皮片；皮肤移植

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纤维蛋白胶(fibrin glue, FG)是一种以纤维蛋白原、ⅩⅢ因子、抑肽酶、凝血酶和钙离子为主要成分的生物粘合剂。FG具有良好的生物相容性和可降解性[1]，可促进血管的生长、形成和组织损伤的修复[2]，并参与体内一系列的病理生理过程。近年来，FG已被应用于普通外科、胃肠外科、神经外科和美容外科等，并取得了良好的临床效果。笔者将FG应用于犬自体网状皮片移植术中，以单纯自体网状皮片移植为对照，观察移植皮片的生长状态，通过HE.染色和Masson 3色法观察移植部位局部组织的修复情况，以评估FG应用于犬自体网状皮片移植术中的临床效果。

1　材料与方法

1.1试验动物

试验动物为健康成年杂种犬 15条，雌雄不拘，体质量15~20 kg，均购自兰州市畜禽交易市场。常规疫苗免疫，试验前安静单笼饲养1周，饲喂全价犬粮，自由饮水。

1.2主要试剂与仪器

主要试剂：猪源纤维蛋白原粉为甘肃农业大学动物医学院临床试验室采用反复冷沉淀法[3]提取(纤维蛋白原纯度(%)为纤维蛋白原浓度与总蛋白浓度的比，纯度＞85%)；500 IU/mL凝血酶原为广州白云山医用胶公司产品；4 500 KIU/mg抑肽酶来自Amresco；氯化钙为天津市大茂化学试剂厂产品；0.9%氯化钠为四川科伦药业股份有限公司产品；陆眠宁Ⅱ为吉林省华牧动物保健品有限公司产品；多聚甲醛为天津市元力化工有限公司产品。

主要仪器：Leica切片机(德国莱卡公司)；OlympusDP–71显微照相系统(日本Olympus公司)；HD–P摊片机；HD–H烘片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；DH3600恒温培养箱(天津市泰斯，特仪器有限公司)；ZHJH–1112C超净工作台(深圳市华弘特净化技术有限公司)。

1.3方法

1.3.1FG的配置

于术前15 min在无菌操作台内制备FG前体物质A液和B液。A液配置方法：将180 mg纤维蛋白原和2 mL灭菌注射用水混合，置于37 ℃水浴锅中轻摇，使纤维蛋白原完全溶解；B液配置方法：将1 000 IU凝血酶原和2 mL 40 mmol/mL氯化钙溶液混合，置于室温下轻摇，使其完全溶解。用双联注射器的2个针筒各吸取1 mL，固定于双联注射器支架内待用。

1.3.2手术方法

前肢皮肤缺损模型的建立：术前禁食12 h，禁水6 h。术前按体质量0.06 mL/kg肌肉注射陆眠宁Ⅱ，进入平稳麻醉状态后，俯卧保定。术部选择在两前肢桡骨正面近端皮肤较平坦区域，常规备皮，避开前肢主要血管，切除3 cm×4 cm范围的全厚皮片，清除创面内皮下组织至深筋膜，彻底止血，完成犬前肢皮肤缺损模型的建立。

供皮区的选择及网状皮片的制备：俯卧保定，选择胸背部皮源充足、毛发旺盛区域作为供皮区。常规备皮，并用手法取皮制备皮片，在胸背部正中线左侧或右侧切取3 cm×4 cm的全厚皮片，用温生理盐水冲洗后平均分为2片，每片1.5 cm×4 cm，固定于无菌木板上，平行于全厚皮片的长轴切制4排网孔，排间距为5 mm，每排含5个7 mm网孔，制备成网状皮片，备用。

网状皮片的移植：将配置好的A液和B液用双联注射器均匀涂布于犬右前肢(试验组)皮肤缺损部位，将制备好的网状皮片真皮层贴合于涂胶创面放置，调整皮片，使其被毛方向与该区域周围健康皮肤被毛方向一致，手指按压固定 1 min，采用 3–0肠线行皮片与受皮区创缘的结节缝合，调整缝线，使创缘对合良好，结节缝合针距约8 mm。对照组以同样的缝合方法进行左前肢单纯网状皮片移植。全部皮肤移植术由同一术者完成。

1.3.3术后护理及观察

采用自制凡士林纱布包扎移植区域，并涂抹适量红霉素软膏预防局部感染。采用弹性绷带和自粘弹性绷带双层加压包扎。术后单笼安静饲养，全程佩戴伊丽莎白圈。6 h后恢复自由饮水，12 h后恢复正常饲喂。全身抗感染治疗(按体质量每1 kg 20万单位肌肉注射青霉素，每天2次)。定期更换包扎的敷料和药物。

术后第3、5、7、14、28 天，观察犬的饮食、大小便、运动和疼痛反应。观察移植皮片外观并进行浅表触诊，记录移植皮片的颜色、质地、肿胀程度、渗出及渗出物性质。术后第100天观察移植区域被毛生长情况。

1.3.4切片制作与观察

于术后第3、5、7、14、28天随机选取3只犬，将其全身麻醉后俯卧保定，采集移植区域桡骨近端0.5 cm×2.5 cm的全层皮片组织。用4 %多聚甲醛固定，制作石蜡切片，采用 HE.染色，于光镜下 40倍观察皮肤附属器官的发育，100倍观察炎性浸润范围与肉芽生长情况，400倍观察成纤维细胞数量与排列。Masson 3色法染色切片，观察胶原的排列与数量。

2　结果与分析

2.1犬的饮食、大小便、运动和疼痛反应情况

试验动物在术后全部存活，饮食、大小便及运动均正常。术后第3天，试验组和对照组均表现出较强烈的疼痛反应，第5天疼痛反应减轻，第7天所有犬疼痛反应微弱，第14天和第28天疼痛反应消失，精神状态良好。

2.2移植皮片的局部观察结果

术后第3天，2组皮片均呈白色，质地柔软，轻微水肿，试验组移植表面局部有少量血性渗出，移植皮片中央网孔创围呈红色，对照组的渗出较试验组的多，红色创围的面积较试验组的大；第5天，网孔创缘仍水肿，创围呈红色，但试验组创缘收缩明显，渗出减少，对照组血性渗出未见减少；第 7天，2组皮片局部红肿减轻，与受皮区创缘结合较为紧密，与对照组相比，试验组皮片网孔明显缩小，未见渗出，肉芽组织饱满、鲜嫩；第14天，试验组皮片质地柔软，肉芽组织基本与创缘持平，且大部分被上皮覆盖，仅有少许残留创面，对照组皮片颜色较试验组苍白，网孔未被完全填充；第28天，2组移植皮片生长良好，质地柔软有弹性，试验组皮片网孔收缩后呈细线形瘢痕(图1–A)，对照组网孔收缩不规则，瘢痕明显(图1–B)；第100天，试验组被毛较对照组浓密(图1–C)，与供皮区被毛外观相似(图1–D)。

图1　移植创面的局部观察结果Fig.1 Part observation in the transplant area

2.3移植创面的组织学观察结果

术后第3天，100倍镜下可见试验组皮片充血程度、真皮下毛细血管扩张程度及炎性细胞浸润范围均小于对照组，炎性细胞浸润区域有新生毛细血管芽，对照组未见；第5天，与对照组相比，试验组肉芽组织、新生毛细血管和新生毛囊较多，炎性细胞浸润范围小；第7天，2组皮片的真皮层均可见新生毛细血管、成纤维细胞大量浸润和胶原增生，与对照组相比，400倍镜下可见试验组表皮细胞层数增加，颗粒层细胞明显增多，真皮层成纤维细胞排列规则，炎性细胞较少(图2–A、B)；第14天，100倍镜下对照组上皮细胞增生少，成纤维细胞和新生胶原纤维排列不规则，真皮层有少量炎性细胞，而试验组新生胶原纤维排列规则，毛囊周围有胶原纤维环绕，真皮各层结构清晰，未见炎性细胞(图2–C、D)；第28天，与试验组相比，对照组表皮进一步增生变厚，有明显毛囊新生，肉芽组织大量生成，胶原纤维增粗，排列不规则， 40倍镜下试验组皮肤结构清晰，各层界限明显，毛囊结构完整，胶原纤维紧密包围毛囊，排列整齐(图2–E、F、G、H)。

图2　移植创面的组织学观察结果Fig.2 Histopathological observation in the transplant area

3　结论与讨论

网状皮片移植术有效解决了皮源匮乏问题，可用于治疗犬四肢皮肤缺损。传统的网状植皮加压打包方法难以使移植皮片与受皮创面完全紧密贴服，在肢体活动时可能导致移植皮片移位，不能完全去除死腔，且受皮创面范围较大，受皮区皮下脂肪较多时血管稀少，与皮片建立脉管连接较困难。有研究表明，移植皮片在术后第7天内必须形成稳定的脉管系统，否则皮片会死亡[4]。为保证网状皮片在移植后尽快建立血运，需将受皮区过多的皮下组织去除，但上述操作常常增大了皮片与受皮区的间隙，导致皮片成活困难。本试验中采用FG配合网状皮片移植术，利用FG可填补缺损、粘合的特点，填充了皮片与受皮区的间隙，使皮片在受体床上的贴合更加稳固。网状皮片是在全厚皮片的基础上，用器械做数个网孔制备而成，每个网孔虽可作为一个独立的引流系统，在一定程度上排出渗出液和积液，但同时每个网孔又成为一个独立的创伤，不能有效隔绝细菌的侵入和滋生，从而使网状皮片移植术中的感染率增高。试验组采用FG涂布创面，在完成网状皮片移植后短时间内封闭网孔，减少了细菌的入侵，降低了术后感染的风险。本试验中受皮区为前肢桡骨正面近端。该处皮下血管丰富，按压止血较为困难，用止血钳钳夹与结扎易造成组织挫灭增多，使炎性清除期延长，加重术后渗出，而FG良好的止血效果可减少术后皮片下血肿、血清肿的发生[5]。可见，试验组比对照组渗出较少且持续时间较短的主要原因是FG填充了皮片与受皮区间的死腔，使皮片在稳固贴合的同时完成了创面止血[6]，为血管的新生与炎性清除创造了良好的环境。

创伤愈合早期，FG中的纤维蛋白可作为细胞迁移的支架与组织修复的介质[7]，刺激成纤维细胞、巨噬细胞及上皮细胞向创伤部位移动、粘附和增殖[8–9]，促进其吞噬变性胶原和其他碎片[10]；另外，纤维蛋白的网状结构可网罗细胞因子，提高局部细胞因子浓度，加强细胞因子对靶细胞的作用，因此，与对照组相比，试验组的炎性反应程度低，炎性反应时间短。新生毛细血管数量和成纤维细胞较多的原因可能与此相关。毛细血管和成纤维细胞作为肉芽组织的主要成分，可以填充组织缺损部位，增强创面抗感染的能力，在发生收缩后有利于创面的愈合，并为再上皮化创造条件，加速组织愈合进程[11–12]。肉芽组织是胶原沉积和改建的场所，而成纤维细胞是早期创伤修复过程中肉芽组织的主要功能细胞。较长的炎性反应期中各种炎性细胞因子刺激成纤维细胞产生过量的胶原是瘢痕过度增生的原因之一[13]；成纤维细胞在创面上皮化后受碱性成纤维细胞因子的刺激继续旺盛增殖，合成各种构成瘢痕组织的细胞外基质。有研究表明，FG应用14 d后，愈合进入再塑形期，碱性成纤维细胞生长因子回落到低浓度[14]。本试验中，FG的使用缩短了炎性反应期，且在创面上未引起瘢痕组织过度增生，因此，试验组在应用FG 14 d后，肉芽组织中的胶原纤维较对照组的细，且排列更规则，皮片移植区各层的结构与功能较完整。

综合分析结果表明，FG可缩短炎性清除期并加快新生血管形成，有利于肉芽组织上皮化和细胞外基质的整合，加快移植皮片创面修复和改建进程，促进移植皮片愈合，减少瘢痕组织过度增生，能使成活后的移植皮片结构和功能更接近正常皮肤。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王 库

Observation the transplant effects of glue fibrin on dog mesh skin graft surgery

Kang Xin1, Chen Zhihua1*, Guo Huilin2, Fan Xiping1, Gao Yuhang1, Nian Jupen1, Han Peng1
(College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2.Gansu Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention, Lanzhou 730046, China)

In order to investigate the effects of glue fibrin (FG) on the transplantation of autologous mesh skin graft in dogs, 15 dogs as experimental animal were selected to set up a model of whole layer skin defection with 3 cm×4 cm at their two forelimbs. The chest and back were selected as donor area; By adopting the usage of FG in dog mesh skin graft surgery as test group and the single mesh skin graft surgery as control, three dogs were randomly selected for whole and part observation in skin graft at the 3rd, the 5th, the 7th, the 14thand the 28thday, the paraffin sections were made for histological observation as well. The part observation result showed that swelling and exudation in the test group was lighter than that in the control, inflammatory reaction period was shorter in the test group; after surgery of 28 days, all skin grafts grew well, and linear scar in the test group was less than that in the control. The result from histopathology observation showed that the time of inflammatory cell infiltration was short; the collagen fibers arranged regularly; and skin appendages was complete in the test group. The results showed that FG could shorten the inflammatory response period, enhance the ability of local tissue repair and reduce scar hyperplasia, which made the structure and function of survival skin grafts closer to the normal skin.

dog; fibrin glue; mesh skin graft; dermatoplasty

亢心(1989—)，女，甘肃平凉市，硕士研究生，主要从事小动物疾病诊疗技术研究，vetkang@126.com；*通信作者，郭慧琳，教授，主要从事临床兽医学研究，13609320234@126.com

S857.13+2

A

1007-1032(2016)04-0415-04

2015–12–01 修回日期：2016–06–16

甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSW–2011–26)