溃疡性结肠炎患者外周血CD1d(hi) CD5+ CD19+调节性B细胞的变化和临床意义

刘玲玲，金小晶，杨　勤，崔占清

(江苏省南京市中医院，江苏 南京 210001)



溃疡性结肠炎患者外周血CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞的变化和临床意义

刘玲玲，金小晶，杨勤，崔占清

(江苏省南京市中医院，江苏 南京 210001)

[摘要]目的检测溃疡性结肠炎(UC)患者外周血调节性B细胞含量的变化，探讨其在 UC病情活动性与严重性评价中的价值。方法采用ELISA法检测43例活动期UC患者、33例缓解期UC患者及30例健康对照者的外周血调节性B细胞含量，并评价活动期UC患者病情轻重程度，规范治疗后复查血调节性B细胞含量。结果活动期UC患者外周血调节性B细胞含量和CRP水平显著高于缓解期UC患者和正常组(P均<0.05)，缓解期UC患者外周血调节性B细胞含量和CRP水平与正常组比较无明显升高(P>0.05)；外周血调节性B细胞含量与活动期UC病情活动性、病情轻重程度均呈正相关(r=0.638,0.541，P<0.05)。结论活动期UC患者外周血调节性B细胞含量显著升高，其可作为病情活动性、严重性及疗效评价的参考指标。

[关键词]溃疡性结肠炎；炎症性肠病；调节性B细胞

溃疡性结肠炎(UC)是一种非特异性的肠道炎症性疾病，其确切发病机制尚未明确，可能与环境、遗传、感染、免疫、精神紧张及过敏等因素有关。目前认为，免疫异常及肠道持续的炎症损伤是其基本发病机制[1]。B细胞作为机体中一类重要的免疫细胞，在免疫和炎症反应中行使着多种功能，B细胞不仅可以介导体液免疫和细胞免疫发挥正性免疫调节作用，近年来的研究显示B细胞中还存在着发挥负性调节作用的细胞亚群[2]。CD1d(hi)CD5+CD19+B细胞是新近报道的一种发挥负性调节作用的细胞，其免疫调节作用已在多种疾病模型中得到证实[3-4]。然而有关这类细胞在UC患者中的研究不多，尤其在疾病过程中其数量比例以及功能的动态变化尚不清楚。本研究检测UC活动期和缓解期CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞的变化，评价其在UC病情活动性与严重性中的临床意义。

1临床资料

1.1一般资料选择本院2014年1—6月住院治疗的UC患者76例，其中活动性患者43例，男24例，女19例；年龄30～61(44.6±13.8)岁。缓解期患者33例，男15例，女18例；年龄29～58(40.5±15.2)岁。诊断及临床分度符合中华医学会消化病分化炎症性肠病学科组制定的诊断指南[5]，并均排除近期急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤性疾病、慢性纤维化增生性疾病和播散性血管内凝血，并均未接受任何免疫抑制剂治疗。采用Rachmilewitz UC临床活动指数评估系统(CAI评分)评价病情活动性，>4分为活动性，<4分为缓解期[6]。活动期患者按病情严重程度分为轻型、中型、重型。 缓解期患者：3例接受氨基水杨酸制剂治疗，30例曾使用过激素和氨基水杨酸制剂联合治疗。选择健康志愿者30例作为正常组，男17例，女13例；年龄 29～59(42.5±10.5)岁。

1.2方法

1.2.1标本收集用肝素锂抗凝管抽取早晨时UC患者和健康对照者外周静脉血自采血完毕后3 h内进行试验。

1.2.2单个核细胞的提取和培养将2 mL全血和2 mL PBS按1∶1充分混匀后沿管壁缓慢加入3 mL淋巴细胞提取液ficoll离心管中。1 500 r/min水平离心30 min。离心后可见试管内容物可分为4层：第一层为血浆层，第二层为分离液层，单个核细胞层处于血浆层和分离液层中间，底层为红细胞层。红细胞层上为粒细胞层；用一次性吸管吸取单个核细胞层收集到另一离心管中；加入6 mL PBS以1 500 r/min，10 min，洗涤2次，弃上清后加RPMI 1640，将细胞数调至2×106个/mL，吸取0.5 mL，加入falcon流式管中，加入刺激剂Golgi(含刀豆蛋白A，脂多糖，离子霉素，葡萄球菌肠毒素B等)2 μL置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.3血清CRP测定血清CRP测定使用德林公司提供的型号为Behring Nephelometer 100分析仪，以散射光比浊法定量测定其浓度。

1.2.4细胞表面和细胞内染色和流式细胞仪测定向falcon管中分别加入10 μL CD5-FITC和CD19-PE充分混匀，室温避光15 min，加入FIX RERM Reagent(A)100 μL，混匀，室温避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清加FIX RERM Reagent(B)100 μL，同时向管中加IL-10APC 5 μL混匀,室温避光15 min，加3 mL PBS，1 500 r/min离心5 min，弃上清,加500 μL PBS上流式细胞仪检测。

1.3统计学方法所测数据以均数±标准差表示，应用Spass 18.0医学统计软件处理，组间整体比较采用单因素方差分析。2组间数据的比较采用t检验，相关分析采用Pearson等级相关法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组CAI评分、CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞及C反应蛋白比较活动期UC患者血CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞水平高于缓解期UC组和正常组(P均<0.05)，与正常组相比，缓解期UC组CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞及C反应蛋白含量升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。活动期UC组CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞数量与CAI评分呈正相关(r=0.568,P<0.05)，与C反应蛋白呈正相关(r=0.532,P<0.01)。见表1。

表1　3组CAI评分、调节性B细胞及CRP比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与缓解期UC组比较，P<0.05。

2.2活动期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞与病情严重性的关系活动期UC期患者CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞与病情严重性呈正相关(r=0.638,P<0.05),CRP含量与病情严重性呈正相关(r=0.541,P<0.05)。轻型活动期UC患者CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞及CRP水平明显低于中型和重型患者，中型上述指标水平明显低于重型患者，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2　活动期UC患者各型调节性B细胞及

注：①与轻型活动期UC组比较，P<0.05；②与重型活动期UC组比较，P<0.05。

3讨论

溃疡性结肠炎是一种主要累及直肠的非特异性炎性疾病, 肠道局部炎性损伤是其重要病理改变,以大量炎性细胞浸润肠壁和持续活化为特征[7-8]。尽管有关炎性细胞向炎症部位募集的具体机制尚不十分清楚,但可以肯定的炎症细胞在溃疡性结肠炎的发生和发展过程中发挥了重要的作用。评价溃疡性结肠炎的活动性和严重性，是制定正确治疗方案和评估预后所必须。临床上内镜检查和病理活检是评价溃疡性结肠炎的活动性和严重性的金标准，但是内镜检查和病理活检不易重复进行，活检具有创伤性。临床迫切需要寻找新的反应溃疡性结肠炎的活动性和严重性的标记物。临床上测评UC治疗过程需要客观指标来评价病情的活动性、严重性，然而目前缺乏一些简单实用、客观敏感的评价指标[9]。

近年研究发现，表型为CD1d(hi)CD5+CD19+调节性B细胞是一种新型具有负向调节功能的B细胞，其数量和功能的异常可能是自身免疫病发生的重要机制[2]。目前，对Bregs抑制免疫炎症的机制通过如下几个方面实现：①Bregs主要通过分泌IL-10和TGF-β等发挥免疫调节功能。Bregs产生的IL-10通过调节T细胞分化影响疾病过程[10]， 如在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)中，可调节Th1/Th2平衡抑制有害免疫应答[11]。 巨噬细胞和树突状细胞也是IL-10是发挥抑制性调节作用的主要靶细胞，减少巨噬细胞或单核细胞炎症因子的释放,减轻炎症反应[12]。②Bregs通过细胞间接触发挥调节作用。研究表明，Bregs通过直接的MHC和B7这2条途径，促进调节性T细胞的增殖和活性，通过fas/fasl介导的凋亡机制来抑制效应性T细胞的增殖[13-14]。③与其他调节性免疫细胞之间的相互作用研究表明，Bregs可与CD4+T细胞共培养能数量依赖性地降低CD4+T细胞的增殖能力[15]。

本研究显示活动期UC患者血调节性B细胞及CRP含量高于缓解期UC患者和正常者;缓解期UC患者调节性B细胞及CRP含量较正常组无明显升高，活动其UC患者CAI评分显著高于缓解期UC患者。活动期UC患者血调节性B细胞数量和病情严重性一致，与病情活动指数CAI评分呈正相关，与正常组相比，轻型活动其UC患者CRP含量无明显升高，而血调节性调节性B细胞数量显著升高，提示轻型活动期UC患者中血调节性B细胞较CRP更加敏感地反映出病情严重性的变化。

本研究结果表明活动期UC患者调节性B细胞变化可作为评价病情活动性与严重性的良好指标，有助于判断临床治疗效果，评价预后。

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doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.22.018

[中图分类号]R574.62

[文献标识码]B

[文章编号]1008-8849(2016)22-2447-03

[收稿日期]2015-07-15