心肌缺血损伤大鼠心肌P2X3受体mRNA表达的变化

董亚琴，黄倩茹，万　　隆，许金森（福建省中医药研究院，福建 福州 350003）

心肌缺血损伤大鼠心肌P2X3受体mRNA表达的变化

董亚琴，黄倩茹，万隆，许金森
（福建省中医药研究院，福建 福州 350003）

目的观察异丙肾上腺素（ISO）诱发大鼠心肌缺血损伤时，模型大鼠心肌P2X3受体mRNA表达的变化。方法成年雄性SD大鼠16只，随机分为心肌缺血损伤组和对照组，每组8只，采用Q-PCR法观察心肌缺血损伤组心肌P2X3受体mRNA表达的变化。结果心肌缺血损伤组大鼠心肌P2X3受体mRNA表达较对照组明显升高，具有统计学意义。结论心肌缺血损伤模型大鼠心肌P2X3受体表达增加，说明P2X3受体在心肌缺血损伤时敏感性明显增强，参与了心肌缺血损伤的病理变化过程。

心肌缺血；P2X3受体；异丙肾上腺素

异丙肾上腺素会导致大鼠急性心肌缺血损伤，这种损伤与人体急性心肌缺血相似［1-2］。心肌缺血损伤时大量释放的三磷酸腺苷（ATP）可引起心绞痛等疼痛症状［3］。P2X3受体是ATP的主要受体，在疼痛的传递和处理中起重要作用［4］。P2X3受体在大剂量ATP导致的心功能异常中的作用尚不清楚，本实验通过观察大鼠心肌缺血损伤时，心肌P2X3受体mRNA的表达变化，了解P2X3受体在心功能异常时的作用。

1材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠，体质量220～250 g，福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2012-0001。

1.2主要试剂及仪器

1.2.1主要试剂异丙肾上腺素（ISO）（美国Sigma公司）；Sybr premix ExTaq TM（日本TakaRa公司）；Trizol Reagent（美国invitrogen公司）；PrimeScript逆转录试剂盒（日本TakaRa公司）；引物由日本TakaRa公司合成。

1.2.2主要仪器7500 Fast Real-Time PCR System（美国 Applied Biosystems公司）；梯度荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；Allegra 64R型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；微量加样枪（德国Eppendorf公司）；NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3心肌缺血损伤大鼠模型的制作雄性SD大鼠16只，随机分为心肌缺血损伤组和对照组，每组8只。心肌缺血损伤模型的制作方法：按每日60mg/kg的剂量（40 mg/mL溶于生理盐水中）于背部皮下多部位注射异丙肾上腺素，连续注射2 d，间隔24 h。对照组于背部皮下多部位注射与模型组等量的生理盐水，连续注射2 d，间隔24 h。心肌缺血损伤大鼠模型制模成功的心电图出现S-T段下移，异常Q波。

1.4RNA的提取和质量检测制模成功次日，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后断颈处死，立即取出心脏组织，用PBS冲洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鲜冻存心脏组织，将左心室剪成所需大小组织，用Trizol一步法提取细胞中的总RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测RNA纯度和浓度。1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。

1.5实时荧光定量PCR每个样本分别取2 μg 总RNA进行逆转录，所得cDNA于-80℃保存。引物序列见表1。

荧光定量 PCR反应体系：Sybr premix ExTaq TM 10 μL，primer-F：0.4 μL，primer-R：0.4 μL，ROX II：0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，cDNA 2 μL，20 μL体系。反应条件：① 预变性 95℃30 s；② 变性：95℃5 s；③ 退火，延伸，60℃30 s，40个循环。采用ABI 7500 Real time PCR仪检测各样本中mRNA的表达情况。实验采用ΔΔCt法：每个标本重复3次，Ct值取平均值；以GAPDH作为内参照，ΔCt值＝P2X3基因Ct值－GAPDH基因Ct值；以生理盐水组为对照，ΔΔCt值＝心肌缺血损伤组心肌P2X3的ΔCt值－生理盐水对照组心肌P2X3的ΔCt值。以生理盐水对照组心肌P2X3的基因表达量为 1，2-ΔΔCt值即为心肌缺血损伤组心肌P2X3基因表达的倍数，测定值以2-ΔΔCt≥2作为高表达的标准。

2结果

实验结果见表2。

表2　2组大鼠心肌P2X3受体mRNA的表达

3讨论

注射ISO制备心肌缺血损伤模型是常见的研究模型之一，大鼠注射ISO后心肌组织缺血坏死导致心肌细胞膜破坏，释放ATP。ATP不仅是细胞内的能量物质，而且可以作用于细胞表面的嘌呤受体产生信号传导作用。P2X3受体是ATP的主要受体，在伤害性信息（疼痛）的传递和处理中起重要作用。本实验结果显示，与生理盐水对照组比较，心肌缺血大鼠心肌P2X3受体mRNA表达明显升高，具有统计学意义。心肌缺血大鼠心肌P2X3受体表达的增加，表明P2X3受体在心肌缺血损伤时敏感性明显增强，参与了心肌缺血损伤的病理变化过程。ATP作用于P2X3受体引发痛觉及伤害性信息传递，从而导致心肌缺血引起心绞痛等伤害性反应。

［1］高海成，孙波，苗春生，等.大剂量盐酸异丙肾上腺素诱发大鼠心肌缺血性坏死模型的建立 ［J］.中国生物制品学杂志，2009，22（3）：288-290.

［2］张云，王阶，郭丽丽.异丙肾上腺素诱导心肌缺血损伤模型的研究进展［J］.医学综述，2010，16（23）：3527-3531.

［3］严琴，张英，刘雨生，等.电针内关穴对心肌痛大鼠心肌和下丘脑P2X3受体影响的研究［J］.湖北中医药大学学报，2014，16（5）：5-8.

［4］GINIATULIN R，NISTRI A.Desensitization properties of P2X3 receptors shaping pain signaling［J］.Frontiers in Cellular Neuroscience，2013，7：245.

R-332

B

1000-338X（2016）03-0022-02

2016-03-02

国家自然科学基金青年项目资助课题（81403490），福建省科技厅省属公益类项目（2014R1035-6），福建省教育厅中青年教师教育科研B类项目资助课题（JB14050）

董亚琴（1979—），女，助理研究员，硕士，主要从事中医经络现代研究。

许金森（1963—），男，研究员。E-mail：xujinsenjls@163.com