miRNA-16对肺腺癌A549细胞增殖和VEGF-A表达水平的影响

徐 胜，束 军，李晓峰，程 宇，沈继龙

miRNA-16对肺腺癌A549细胞增殖和VEGF-A表达水平的影响

徐 胜1，束 军1，李晓峰1，程 宇1，沈继龙2

目的 探讨miRNA-16作用不同时间对体外培养的人肺腺癌A549细胞增殖的影响，以及对VEGF-A表达水平的影响。方法 将50 nmol/L的miRNA-16和阴性对照序列用Lipofectamine 2000转染进人肺腺癌A549细胞中，通过qRT-PCR法检测转染后A549细胞中miRNA-16的表达水平，MTT法检测转染miRNA-16后细胞的增殖抑制情况，ELISA法检测转染m iRNA-16后细胞VEGF-A表达水平。结果 转染培养24 h后，测得转染组miRNA-16表达水平明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）；转染组细胞增殖抑制率明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）；转染组细胞VEGF-A表达水平较阴性对照组和空白对照组明显降低（P＜0.05）。结论 miRNA-16能引起细胞增殖抑制，并且可能与下调VEGF-A的表达有关。

肺腺癌；VEGF-A；miRNA-16；细胞增殖

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.014.htm l

肺癌是当今世界男性、发达国家女性癌症引起的死亡原因最高的病种，在发展中国家女性病死率仅次于乳腺癌［1］。其发病率在中国也呈逐年上升趋势，造成了沉重的社会负担。非小细胞肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等，占肺癌总数的80%。而肺腺癌又是占比最多的非小细胞肺癌类型。微小RNA（miRNAs）在人类多种疾病特别是癌症发生、发展过程中扮演重要角色，通过对基因的转录后调节实现对癌细胞增殖、凋亡等进程的影响，从而在肿瘤生长、侵袭及迁移方面发挥重要作用。该研究旨在探讨miRNA-16对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）-A是否存在作用，以及是否通过这种作用引起肺腺癌A549细胞增殖情况发生变化。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器 人肺腺癌A549细胞株由安徽医科大学基础医学院提供。hsa-miRNA-16 mimics和阴性对照以及miRNA-16 qPCR Quantitation Kit和U6 snRNA qPCR Normalization Kit均由上海吉玛制药技术有限公司合成。hsa-miRNA-16 mimics上游引物：5′-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3′，下游引物：5′-CCAAUAUUUACGUGCUGCUAUU-3′；阴性对照上游引物：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物：5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′。胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；DMEM培养基购自美国HyClone公司；MTT、DMSO购自美国 Sigma公司；人 VEGF-A ELISA试剂盒购自上海源叶生物有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；无菌无酶枪头购自美国Axygen公司；TRIzol试剂购自杭州诺唯赞公司；CO2细胞培养箱购自德国Heraeus公司；ELX800UV酶标仪购自美国Bio-Tek公司；ABI PRISM 7300荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度计购自美国Thermo公司；电热恒温水浴锅购自上海天平仪器有限公司；超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司。

1.2细胞培养 人肺腺癌A549细胞株用含2 mmol/L的谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内常规传代培养，待细胞生长融合至覆盖瓶底80%～90%时用胰酶消化并反复吹打，分瓶传代培养。

1.3qRT-PCR法检测转染miRNA-16后肺腺癌A549细胞miRNA-16的表达水平 取对数生长期细胞（2×105/孔）接种于6孔板，待细胞贴壁且融合度达到50%左右进行转染，转染miRNA-16 mimics浓度为50 nmol/L。转染按照Lipofectamine 2000说明书进行。实验分3组，转染了miRNA-16 mimics的细胞（转染组），转染了阴性对照序列的细胞（阴性对照组），未做转染处理的细胞（空白对照组）。转染后置于37℃，5%CO2细胞培养箱内继续培养。6 h后去掉含转染液的培养基。加入含10%胎牛血清的1640培养基继续培养。转染24 h后，开始提取RNA。提取RNA的步骤按照TRIzol说明书进行。在紫外分光光度仪上测吸光度（absorbance，A）值，A260及 A280值。计算RNA浓度和纯度。计算A260/A280，取其值在1.8～2.0之间用于qRT-PCR法检测。实验分逆转录和PCR扩增两个阶段。反应以U6做内参。逆转录为20μl反应体系，逆转录反应条件：25℃、30 min，42℃、30 min，85℃、5 min。PCR扩增反应条件：、95℃预变性3 min；PCR反应阶段为95℃、12 s，62℃、40 s，共40个循环。通过qRT-PCR仪进行检测，得出Ct值。实验结果计算以U6为内参，空白对照组为基准，ΔCt=（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct，ΔΔCt=［（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct］转染组-［（hsa-miR-16）Ct-（U6）Ct］空白对照组，表达水平按照2-ΔΔCt计算。

1.4MTT法检测转染后细胞增殖抑制情况

0.25%胰酶消化对数期细胞，终止消化后1 000 r/ min离心5 min收集，用培养液制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。实验分为转染组、阴性对照组和空白对照组。取每孔100μl接种于96孔板。边缘孔加无菌PBS。置于37℃、5%CO2培养24 h后进行转染。转染后分别在24、48、72 h 3个时间点进行检测。每孔内加入10μl MTT，继续培养4 h后，形成结晶后弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，摇床振荡10 min，置于酶标仪于490 nm处检测光密度（optical density，OD）值。每组设置5个副孔，组内取平均值。比较组间差异，实验重复3次。

1.5ELISA法检测上清中VEGF-A的表达水平

转染48 h后，收集空白对照组、阴性对照组以及转染组的肺腺癌A549细胞上清液。从4℃冰箱取出ELISA试剂盒，室温放置30 min，按照说明书稀释标准品，将其配制成不同浓度，检测时设空白孔、待测样品孔和标准品孔。待测样品即3组A549细胞的上清液，以空白孔作为调零，然后使用酶标仪在450 nm处进行各孔OD值的测定，通过EXCEL工作表绘制出标准品线性回归曲线，再根据各样品孔的OD值按照曲线方程计算出各个样品浓度值。该检测方法的灵敏度为1 pg/ml（最低检测浓度小于1 pg/m l）。

1.6统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行分析。计量资料以±s表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较比较采用SNK-q检验。时间因素对MTT实验的影响采用重复测量资料的方差分析。

2　结果

2.1转染m iRNA-16对于细胞内m iRNA-16表达水平的影响 转染并培养24 h后，转染组细胞内miRNA-16表达水平与阴性对照组和空白对照组比较明显升高。其表达水平约为空白对照组的（467.59±35.47）倍，差异有统计学意义（F= 407.149，P＜0.05）。而阴性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义，见图1。

图1　转染24 h后各组　A549细胞内　m iRNA-16表达水平A：转染组；B：阴性对照组；C：空白对照组；与阴性对照组比较：*P＜0.05；与空白对照组比较：#P＜0.05

2.2转染m iRNA-16对细胞增殖的影响 为了研究转染miRNA-16后细胞增殖是否受到抑制，本实验采用MTT法检测miRNA-16对于细胞增殖的影响。转染24、48、72 h后检测3组OD值，见表1。经球形检验χ2=1.981，P=0.371，表明符合球形分布，以一元方差结果为准。不同测试时间点间OD值不同，受时间影响（F=1037，P＜0.05）。测试时间组与组别间有交互作用（F=53.212，P＜0.05）。组别间OD值差异有统计学意义（F=145.455，P＜0.05）。同时间点miRNA-16转染组的OD值明显低于空白对照组，差异有统计学意义（F24h= 70.234、F48h=181.009、F72h=1 211.030，P＜0.05）。而阴性对照组和空白对照组比较，差异无统计学意义。

2.3A549细胞上清液中VEGF-A含量的检测

转染48 h后，检测各组VEGF-A浓度结果可得：空白对照组（146.43±7.71）pg/ml，阴性对照组（152.07±6.41）pg/m l，转染组（55.56±6.04）pg/ m l。转染组细胞上清液中有少量的VEGF-A表达，且与空白对照组和阴性对照组相比显著下降，差异具有统计学意义（F=192.59，P＜0.05），空白对照组和阴性对照组比较VEGF-A表达差异无统计学意义。见图1。

表1　转染m iRNA-16 m im ics对A549细胞24、48、72 h增殖的影响（n=5，±s）

表1　转染m iRNA-16 m im ics对A549细胞24、48、72 h增殖的影响（n=5，±s）

与阴性对照组比较：*P＜0.05；与空白对照组比较：#P＜0.05

OD值组别24 h　48 h　72 h空白对照0.567±0.025　0.688±0.022　0.907±0.018阴性对照　0.561±0.020　0.678±0.026　0.895±0.019转染　0.471±0.028*#　0.543±0.021*#　0.623±0.016*#

图1　转染　m iRNA-16后各组细胞上清液中VEGF-A表达水平A：空白对照组；B：阴性对照组；C：转染组；与空白对照组比较：*P＜0.05；与阴性对照组比较：#P＜0.05

3　讨论

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%［2］，肺腺癌占非小细胞肺癌的比例逐年升高，现已超过肺鳞癌成为最大的一类非小细胞肺癌。大多数的肺癌患者在最终确诊时已处于癌症晚期，发生了远处转移和扩散，失去了最佳治疗时机。尽管疾病监控与临床治疗措施取得了很大的进展，但是患者术后5年生存率却依然在30%～60%。潜在的调节肺癌发生发展的分子生物学机制成为相关领域研究的热点之一。

miRNAs是一大类存在于生物体内长约19～22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过结合靶mRNA 的3′-UTR，导致翻译停滞或者mRNA的降解，从而达到抑制基因表达的效果，是一种基因表达的转录后调节。既往大量研究表明，miRNAs与多种疾病的调节有关，在多种肿瘤如肝癌、结肠癌［3］以及结缔组织病如骨性关节炎［4］中均有异常表达，并诱导癌细胞产生增殖抑制、侵袭性和转移能力下降等生物学行为，从而在癌症发生发展进程中扮演重要作用。在肺癌领域也有关于miRNAs的作用研究。Let-7是第一个被发现在肺癌中表达失调的miRNA。Takamizawa etal［5］曾报道Let-7在肺癌中的表达通常是下降的。miRNA-152能引起非小细胞肺癌细胞增殖抑制、凋亡、抑制癌细胞迁移和侵袭等［6］。

既往曾有关于miRNA-16在卵巢癌［7］和慢性粒细胞性白血病［8］中的研究，亦有一项研究［9］表明miRNA-16在肺癌组织中的表达较自身的健康肺组织中的表达是下调的。为了研究转染后非小细胞肺癌A549细胞内miRNA-16表达水平是否升高，本研究通过qRT-PCR法检测得出转染miRNA-16 mimics的细胞miRNA-16表达水平明显高于空白对照组。为了研究miRNA-16高表达对于细胞增殖是否有抑制作用，本实验采用MTT法检测显示转染组和空白对照组相比细胞增殖明显受抑制。

血管能为肿瘤的生长提供所需营养物质，而肿瘤在生长过程中也会有大量新生血管生成，这是内皮细胞迁移并增殖产生的结果，大量新生血管的形成也导致了肿瘤的快速生长。肿瘤的血液转移是转移的主要途径之一，能使癌细胞扩散至其它器官引起癌变。通过抑制新生血管的形成来达到治疗恶性肿瘤的目的已成为近些年研究热点之一。VEGF是目前公认的最强也是最有效的一种促血管生长的特异性因子。VEGF家族主要分为 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E五大类。其中VEGF-A基因位于6号染色体的6q21上，主要作用是促进血管内皮生长［10］。研究［11］表明，VEGF能直接刺激非小细胞肺癌细胞的增殖。通过targetscan等miRNA靶基因预测软件，分析 VEGF-A可能是 miRNA-16靶基因。为了验证这一分析推断，本研究采用ELISA法检测了经转染miRNA-16的细胞的VEGFA表达水平，结果显示转染组较空白对照组明显下降。

通过以上实验结果可以推断，miRNA-16可能通过抑制A549细胞内VEGF-A的表达而达到抑制细胞增殖的效应。该结果也提示miRNA-16可能是一种抑癌基因，与miRNA-16在其它系统的肿瘤疾病的研究结果一致。但是miRNAs是一大类RNA，其所能调控的靶mRNA也纷繁复杂，VEGF-A也可以被其它miRNA所调控。故而miRNA-16在肺腺癌A549细胞中的作用机制仍需进一步研究。

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［3］ 龙腾云，余昌俊，张 敏，等.miRNA-139在结直肠癌中的表达及其对癌细胞生长的影响［J］.安徽医科大学学报，2015，50（9）：1258-61.

［4］ 邹 磊，周圆家，饶 峰，等.miRNA-140、MMP-3在OA关节滑液中的表达及相关性研究［J］.安徽医科大学学报，2015，50（9）：1289-92.

［5］ Takamizawa J，KonishiH，Yanagisawa K，etal.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival［J］.Cancer Res，2004，64（11）：3753-6.

［6］ Cheng Z，Ma R，TanW，etal.MiR-152 suppresses the proliferation and invasion of NSCLC cells by inhibiting FGF2［J］.Exp Mol Med，2014，46：e112.

［7］ 韩文君，崔竹梅，唐 蕊，等.miRNA-16抑制人卵巢癌在裸鼠皮下移植瘤生长的研究［J］.海南医学院学报，2012，18（7）：880-7.

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Effect of m iRNA-16 on proliferation and expression of VEGF-A in A549 cells

Xu Sheng，Shu Jun，Li Xiaofeng，et al
（Deptof Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective To observe the effects ofmiRNA-16 on the proliferation and expression of VEGF-A of A549 cells.Methods Human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with 50 nmol/L miRNA-16 mimics or negative controlwith Lipofectamine 2000.24 hours after transfection，the expression level ofmiRNA-16 wasmeasured using qRT-PCR.Cell proliferation wasmeasured by methylthiazol tetrazolium（MTT）assays.The expression level of VEGF-A was tested with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Resu lts The expression level of miRNA-16 in A549 cellswas significantly up-regulated compared with the blank control group and negative control group（P＜0.05）.The proliferation of A549 cellswas obviously inhibited（P＜0.05）.The expression of VEGF-A in A549 cellswas decreased inmiRNA-16 mimics group conpared with other two groups（P＜0.05）.Conclusion

lung adenocarcinoma；VEGF-A；miRNA-16；cell proliferation

R 734.2

A

1000-1492（2016）04-0489-04

2016-01-08接收

安徽省自然科学基金面上项目（编号：1308085MH141）；

安徽医科大学科研基金资助项目（编号：2010xkj115）

1安徽医科大学第四附属医院呼吸内科，合肥 2300222安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室、安徽医科大学基础医学院病原生物学教研室，合肥230032

徐 胜，男，硕士研究生；

束 军，男，医学博士，硕士生导师，责任作者，E-mail：J. Shu@126.com

The results indicate thatmiRNA-16 inhibits the proliferation of A549 cells，which might be associated with the down-regulation of the reduced expression of VEGF-A.