组蛋白去乙酰化酶在酒精致小鼠肝细胞损伤中表达的实验研究

李　星　，黄　成，孟晓明，李　俊　

组蛋白去乙酰化酶在酒精致小鼠肝细胞损伤中表达的实验研究

李星1，2，3，黄成1，2，3，孟晓明1，2，3，李俊1，2，3

目的 研究组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在酒精致小鼠肝细胞损伤中的表达情况。方法 以体外培养的小鼠正常肝细胞株AML12为研究对象，MTT法测定不同浓度和时间点酒精对AML12细胞的抑制作用；流式细胞术检测酒精对AML12细胞凋亡的影响；实时定量PCR法检测酒精致AML12细胞损伤中HDACs的mRNA表达水平。结果 酒精浓度100 mmol/L刺激24 h，AML12细胞的存活率为84%，可以明显抑制小鼠正常肝细胞AML12的增殖（P＜0.05）；酒精浓度100 mmol/L刺激24 h，AML12细胞的凋亡率为16%，可以增加AML12细胞的凋亡（P＜0.05）。在酒精致AML12细胞损伤中，HDAC1、2、3、4、5、6、7、8的 mRNA表达水平均下降（P＜0.05），HDAC9的mRNA表达水平上升（P＜0.05），HDAC10的mRNA表达变化差异无统计学意义。结论 在酒精致肝细胞损伤中，HDACs的表达水平发生不同程度的变化，提示和HDACs相关的表观修饰可能参与酒精性肝损伤的发生发展。

组蛋白去乙酰化酶；酒精性肝损伤；表观修饰

网络出版时间：2016-3-8 8：29：01 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.008.htm l

过量饮酒尤其是短期内大量酗酒可导致酒精在肝内蓄积，使肝细胞发生不同程度的损伤和凋亡，最终导致酒精性肝病的发生发展［1-2］。文献［3］显示，酒精可以改变包括组蛋白和DNA变化的染色质修饰以及转录后变化的表观修饰内容，提示表观遗传学在酒精性肝损伤的发生发展中充当了十分重要的角色。组蛋白乙酰化是重要的表观修饰形式，由组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）这两个功能相互拮抗的蛋白酶家族共同调节。其中，HDACs有4大类［4］，分别是ClassⅠHDACs（HDAC1、2、3、8），ClassⅡHDACs（HDAC 4、5、6、7、9、10），ClassⅢ HDACs（SIRT 1～7），ClassⅣHDACs （HDAC11），目前实验研究大多集中在第一和第二家族。该研究旨在探索HDACs第一和第二家族在酒精致小鼠肝细胞（AML12）损伤中的 mRNA表达情况，为后续研究提供思路。

1　材料与方法

1.1材料 小鼠正常肝细胞来源的AML12细胞系购自美国ATCC细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；无水乙醇（分析纯）购自上海苏懿化学试剂公司；MTT粉、DMSO均购自美国Sigma公司；凋亡试剂盒购自上海贝博生物；TRIzol、寡核苷酸引物购自美国Invitrogen公司；SYBR Green Real-time PCR Master Mix购自日本TaKaRa公司。

1.2仪器 NAPCO-6100型细胞培养箱（美国杜邦公司）；MK3型酶标仪（荷兰雷勃公司）；Coultzer epics XL-MCL型流式细胞仪（美国Beck-man Counter公司）；ND2000超微量核酸蛋白测定仪、实时定量PCR仪（美国Thermo Scientific公司）。

1.3方法

1.3.1细胞培养 小鼠正常肝细胞株AML12，由DMEM/F-12培养基（含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100μg/m l链霉素）于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，2 d换液1次。实验中所用细胞均处于对数生长期。

1.3.2MTT法检测AML12细胞存活率，选择损伤AML12细胞的乙醇浓度 取对数生长期AML12细胞，经胰酶消化后，用DMEM/F-12培养基吹打配成1×105/ml单细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100 μl。待细胞完全贴壁后，实验孔分别加入100μl含乙醇的完全DMEM培养液，致乙醇终浓度分别为50、100、200、300、400、500 mmol/L，正常对照孔则加入100μl不含乙醇的完全DMEM培养液，空白对照孔（不含细胞）加入由100μl DMEM/F-12培养基和100μl完全DMEM培养液组成的复合液，用于MTT测定调零。每组设置至少5个复孔。培养箱中分别孵育12、24、48 h后，加入20μl MTT（5 g/L），继续培养4 h后，去上清液，加入150μl DMSO，在摇床上振动摇匀，在酶标仪490 nm波长下测定各孔的吸光度（absorbance，A）值。实验重复3次。按下式计算肝细胞的存活率：存活率（%）=（实验组A490 nm-空白 对 照组A490 nm）/（对照组A490 nm-空白对照组A490 nm）×100%。以此来确定损伤AML12细胞的乙醇浓度。

1.3.3流式细胞术检测酒精对小鼠正常肝细胞AML12凋亡的影响 对处于对数生长期的AML12细胞，实验组给予100 mmol/L酒精刺激24 h，对照组则不加任何刺激，24 h后，用胰酶消化细胞，并离心收集细胞（2～8℃，2 000 r/min离心5 min），用冷PBS洗涤细胞两次（2～8℃，2 000 r/min离心5 min），最后一次洗涤应将PBS尽量吸干。用400μl 1×Annexin V结合液悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min。15 min后加入10μl PI染色液后轻轻混匀于2～8℃避光条件下孵育5 min。立即用流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.3.4实时荧光定量PCR检测HDACs第一和第二家族目的基因mRNA的表达 在上述筛选出的浓度点和时间点下，用乙醇刺激AML12细胞，分别称为对照组和实验组，TRIzol一步法抽提上述各组细胞总RNA，采用ND2000超微量核酸测定仪测定RNA 260 nm及280 nm处A值，以检测所提取RNA样品的纯度和浓度。将提取的总RNA按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA，产物于-20℃保存。采用荧光定量PCR仪，以β-actin为内参照进行PCR扩增，各基因引物序列见表1。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s、60℃退火30 s、60℃延伸30 s，40个循环，60℃延伸10 min。利用计算机软件（PikoReal Software 2.2）分析各反应的荧光强度。目的基因mRNA相对表达量=目的基因相对定量/内参相对定量，实验重复3次。

1.4统计学处理 所有结果以误差线表示，采用SPSS 17.0软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。

2　结果

2.1乙醇对小鼠正常肝细胞AM L12增殖的影响

取对数生长期的AML12细胞，分别于不同的时间点加入不同浓度的乙醇，以空白对照孔为调零孔，MTT法测定A490 nm值。当乙醇浓度较低 （＜50 mmol/L），作用时间12、24、48 h时对AML12细胞均不表现出明显的抑制作用；随着浓度的升高和作用时间的不断延长，酒精对AML12细胞表现出明显的抑制作用（F12h=113.165、F24h=137.203、F48h= 266.997，P＜0.05），在酒精浓度为100 mmol/L，刺激时间为 24 h时，AML12细胞的存活率为84%。见图1。

表1　实时定量　PCR m RNA引物序列

图1　乙醇对小鼠正常肝细胞　AM L12增殖的影响与0 mmol/L比较：*P＜0.05

2.2乙醇对小鼠正常肝细胞AM L12凋亡的影响

取对数生长期的AML12细胞，实验组给予酒精（100 mmol/L、24 h）刺激，对照组不加任何刺激。与对照组比较，实验组AML12细胞的凋亡率明显大于对照组，因此，本研究采用乙醇100 mmol/L、刺激时间24 h来模拟体外损伤AML12细胞模型（P＜0.05），见图2。

图2　乙醇对小鼠正常肝细胞　AM L12凋亡的影响A：对照组；B：实验组；与对照组比较：*P＜0.05

2.3酒精性肝损伤细胞模型中HDACs目的基因m RNA的表达水平变化 在酒精性肝损伤细胞模型中，HDAC1、2、3、4、5、6、7、8的mRNA表达水平均下降（P＜0.05），HDAC9的mRNA表达水平上升（P＜0.05），HDAC10的mRNA表达与对照组比较无明显变化，见图3。

图3　酒精性肝损伤细胞模型中HDACs目的基因mRNA表达水平变化A～J：HDAC1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；与对照组比较：*P＜0.05

3　讨论

肝脏是乙醇代谢最主要的器官，大量的乙醇摄入可导致肝脏脂质过氧化增加，进而导致肝细胞损伤。同时，乙醇进入机体后，被乙醇脱氢酶等酶类进一步氧化代谢为乙醛和乙酸盐，进而导致三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，最终可导致肝细胞空泡变形［5］。此外，进入机体的乙醇可间接激活枯否细胞，使其分泌大量细胞因子，如肿瘤坏死因子-α、白介素-1和白介素-6等。这些细胞因子的产生也对酒精性肝损伤的形成有重要的意义，可引起肝细胞进一步凋亡、坏死和炎症加重［6］。

对于含有组蛋白或不含组蛋白的基因可逆的脱乙酰化作用是表观修饰中的一种，对于基因表达的调控有十分重要的作用。而这一过程是在HATs和HDACs的共同调节下完成。在近些年的研究［7］中，HDACs对酒精引起的肝损伤以及酒精性肝病的影响越来越瞩目。研究［8-10］表明，酒精的摄入可引起众多肝核和非肝核蛋白的高乙酰化，提示和组蛋白乙酰化相关的表观修饰可能参与了酒精性肝损伤的发生发展。本研究通过构建体外酒精性肝损伤模型，运用实时荧光定量PCR法检测酒精性肝损伤细胞模型中HDACs的mRNA表达情况。实验结果显示，乙醇的摄入可导致HDAC ClassⅠ（HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8），HDAC ClassⅡ（HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7）的mRNA表达抑制，HDAC ClassⅡ（HDAC9）的mRNA表达增加，提示酒精可扰乱肝内HDACs的正常调节机制。这一过程可能是由于酒精代谢引起的肝脏炎症和氧化应激从而导致“转录机器复合物”的结合改变以及不正常的基因表达。

综上所述，在酒精致肝细胞损伤中，HDACs的表达水平发生不同程度的变化，提示HDACs的调节失衡可能参与酒精性肝损伤的发生发展，但具体机制仍不清楚。进一步研究针对各个HDACs的具体功能和特定靶点，而选择性基因敲除小鼠的运用将对于鉴别各个HDACs的功能有很大益处。

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Experim ental study of histone deacetylases in alcohol-induced liver cell injury in m ice

Li Xing1，2，3，Huang Cheng1，2，3，Meng Xiaoming1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，AnhuiMedical University，2AnhuiMedical University Institute of Liver Disease，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression changes of histone deacetylases（HDACs）levels in alcohol-induced liver cell injury in mice.Methods Mice liver cell line（AML12）was used as the research object in vitro，to determine alcohol inhibitory effect on AML12 cells at different concentrations and time points by using MTT method；flow cytometry anlaysis was used to determine alcohol induced apoptosis effect on AML12 cells.Real-time quantitative PCR analysis was used to detectmRNA expression levels of HDACs in alcohol-induced liver cell injury model.Results Upon the stimulation of alcohol concentration at100 mmol/L for24 h，the survival rate of AML12 cellwas84%，indicating its significant role in inhibiting the proliferation of liver cell line（AML12）（P＜0.05）；furthermore，the apoptosis rate of AML12 cellswas16%，showing it could increase the AML12 cell apoptosis（P＜0.05）.Binge alcohol exposure induced liver cell injury and eventually resulted in deregulation of hepatic HDACs mRNA expressions.It could be observed visually that HDAC1，2，3，4，5，6，7，8 mRNA expressions were significantly down-regulated and HDAC9 mRNA expression was up-regulated（P＜0.05）.However，there was no significant difference in HDAC10 mRNA expression than control.Conclusion In alcohol-induced liver cell injurymodel，alcohol consumption affects HDACsmRNA levels and therefore，we speculate that histone deacetylases-mediated epigenetic modificationsmay play an important role in the pathogenesis of alcohol-induced hepatic injury.

histone deacetylases；alcohol-induced liver injury；epigenetic modific-ation

R 96

A

1000-1492（2016）04-0477-04

2015-12-28接收

国家自然科学基金（编号：81473268、81273526）；安徽省科技攻关计划项目（编号：1301042212）；安徽省自然科学基金（编号：1308085MH145）

安徽医科大学1药学院、2肝病研究所，合肥 230032

3安徽省创新药物产业共性研究院，合肥 230032

李 星，女，硕士研究生；

李 俊，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn