悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

刘　琴　王丽平　陈　芳　陈利锋　张　宜

(解放军广州军区武汉总医院医学实验科，武汉430070)



悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

刘琴王丽平陈芳陈利锋①张宜

(解放军广州军区武汉总医院医学实验科，武汉430070)

[摘要]目的：建立兔成纤维样滑膜细胞悬浮组织块分离培养法。方法：取正常兔膝关节滑膜组织，用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞，观察细胞生长状况及形态特征，取第3代对数期细胞，CCK-8法绘制其生长曲线，免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况，并与组织块贴壁法进行比较。结果：两种方法体外培养得到的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样，细胞生长力较旺盛，生长曲线为典型的“S”形，免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论：悬浮组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞，方法简便，效率高，为体外分离培养兔成纤维样滑膜细胞提供了一种新的方法。

[关键词]悬浮组织块法；兔成纤维样滑膜细胞；分离；培养

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性滑膜炎为主要特征的系统性自身免疫性疾病，严重危害着人类健康。滑膜过度增生、增厚是造成关节损伤的主要病理基础之一。成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)为滑膜中最主要的细胞，它参与滑膜增生和组织蛋白酶的分泌，与RA晚期关节损伤有着密切的关系[1,2]。因此，FLS的体外培养是探寻RA发病机制与体外筛选药物的重要手段。成纤维样滑膜细胞分离培养主要方法之一为组织块贴壁法，但存在一定的缺点，如组织块不易贴壁、操作时间长、细胞活性较差等[3,4]。本文采用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞，并与组织块贴壁法作比较。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康新西兰大白兔4只，雄性，体质量1.0 kg，由武汉市新洲区万千佳禾实验动物养殖场提供，生产许可证号：SCXK(鄂)2011-0011，实验单位使用许可证编号：SCXK(鄂)2014-0082。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2主要实验材料及仪器DMEM高糖培养基、PBS(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青链霉素双抗、胰酶、CCK-8(碧云天)；小鼠波形蛋白(Vimentin)抗体、荧光(Cy3标记羊抗小鼠IgG)(武汉博士德生物工程有限公司)；倒置显微镜、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)；CO2细胞培养箱(日本SANYO仪器MCO-175)；生物安全柜(海尔)。

1.2方法

1.2.1组织块悬浮法新西兰大白兔2只，耳缘静脉注射空气处死。75%酒精浸湿膝关节，去皮，1%碘伏与75%酒精依次消毒，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，找出关节囊，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，取出平滑光亮的滑膜层组织，将滑膜组织放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的PBS中。移入超净台中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的PBS洗3次，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿3～4块滑膜组织块，加入2～3 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培养液使其处于悬浮状态，放入37℃、5%CO2培养箱内培养。倒置显微镜下观察细胞的生长形态并照相。4～5 d后进行首次换液，12～14 d后细胞达到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶进行1∶2传代。

1.2.2组织块贴壁法新西兰大白兔2只，耳缘静脉注射空气处死。75%酒精浸湿膝关节，去皮，1%碘伏与75%酒精依次消毒，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，找出关节囊，用手术剪分离关节囊的滑膜层和纤维层，取出平滑光亮的滑膜层组织，将滑膜组织放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的PBS中。移入超净台中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的PBS洗3次，用灭菌的滤纸吸干残留在组织表面的水分，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿7～8块滑膜组织块，平皿于温箱内倒置0.5～1 h后轻轻地加入3～4 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培养液，放入37℃、5%CO2培养箱内培养。3～4 d后进行首次换液。倒置显微镜下观察细胞的生长形态并照相。12～14 d后细胞达到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶进行1∶2 传代。

1.2.3细胞鉴定取第3代细胞，按1×105/孔接种入含有爬片的6孔板中，细胞培养48 h后，吸出培养液，用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定液于4℃固定30 min。PBS洗3次，0.5%Triton X-100室温通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30 min。吸水纸吸掉封闭液，不洗，滴加足够量的Vimentin一抗(1∶100稀释)并放入湿盒，4℃孵育过夜。PBS洗3次，吸水纸吸干爬片上多余液体，滴加稀释好的荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG(1∶100稀释)，湿盒中20～37℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.4细胞生长曲线的测定取第3代细胞，按1×103/孔接种到96孔培养板内，每组设置5个复孔，放在37℃、5%CO2培养箱内培养，分别于培养1、2、3、4、5、6、7 d后随机取出一组，用CCK-8法检测细胞OD值，绘制细胞生长曲线。

2结果

2.1细胞形态观察组织块悬浮法和贴壁法接种3～4 d后，在光镜下可见少量细胞生长，形态多为长梭形，少数为圆形、多角形。6～7 d后，在光镜下可见大量细胞生长，形态仍以长梭形为主，少见多角形、圆形。8～9 d去除组织块。13～15 d，细胞数量增多，达到90%融合，形态为以典型的长梭形为主。初步判断为兔成纤维样滑膜细胞。培养出来的细胞6～7 d可传代一次，传代后大部分细胞4～7 h贴壁，12～24 h开始生长。传至P3时，可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布。传至5～6代时，细胞活性明显下降。两种方法所得到的细胞生长过程和细胞形态如图1。

2.2细胞生长曲线用CCK-8法检测两种方法分离培养得到的第3代兔成纤维样滑膜细胞增殖能力。结果显示：培养出来的细胞增殖能力均较强，经过2 d潜伏期后在第4天进入对数生长期，随着培养时间的增加而增殖，第7天进入平台期，绘制出来的细胞生长曲线呈现典型的“S”形，见图2。

图1　原代兔成纤维样滑膜细胞培养 (×100)Fig.1　Primary culture of rabbit fibroblast-like synovio-cytes(×100)Note: Suspended explant culture method A-D:A.Primary culture for 3-4 days;B.Primary culture for 6-7 days;C.Primary culture for 13-15 days;D.The third passage cells.Explants adherent culture method E-H: E.Primary culture for 3-4 days;F.Primary culture for 6-7 days;G.Primary culture for 13-15 days;H.The third passage cells.

图2　兔成纤维样滑膜细胞生长曲线Fig.2　Growth curve of rabbit fibroblast-like synoviocytes

图3　免疫荧光检测兔成纤维样滑膜细胞胞浆中波形蛋白表达情况Fig.3　Expression of vimentin in rabbit fibroblast-like synoviocytes by immunofluorescence staining

2.3免疫荧光观察免疫荧光检测结果显示，两种方法分离得到的细胞中胚层组织特征性波形蛋白表达强阳性(图3)。

3讨论

目前，成纤维样滑膜细胞原代培养主要方法之一为组织块贴壁法，在操作上存在一定的缺陷。此法的重点是确保滑膜组织块能够牢固贴壁，但在实际操作中很难保证每块组织块都贴壁，尤其是在换液过程中，组织块很容易脱落，造成滑膜组织的浪费[5]。为使滑膜组织块贴壁更加牢固，常需要在加入培养液前将种植有滑膜组织块的培养瓶/皿在温箱内倒置培养1～3 h，有的甚至过夜，耗时较长[6-8]。另一方面，需要人为地将组织块均匀种植在培养瓶瓶/皿中，增加操作时间[9]。

本实验采用悬浮组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞，并与组织块贴壁法进行比较。从新西兰大白兔膝关节中分离得到滑膜组织，剪成1～5 mm3大小，加入DMEM-H+体积分数10%胎牛血清，使组织块处于悬浮状态或贴壁状态，37℃，5%CO2条件下培养，3～4 d后，在光镜下可见细胞生长，形态多为典型的长梭形，偶见多角形和圆形。13～15 d即可达到90%融合，细胞形态以典型的长梭形为主。传代后，可见大量成纤维细胞样细胞均匀分布。CCK-8法检测显示两种方法培养出来的第3代兔成纤维样滑膜细胞呈现典型的“S”形，与文献报道一致[10]。传至5～6代时，细胞趋于老化，7～8代之后几乎完全丧失增殖活性，建议采用3～4代细胞进行相关实验。两种方法所得到的兔成纤维样滑膜细胞生长过程和细胞形态学很相似，并无明显区别。

对于成纤维样滑膜细胞的特异分子标志目前尚无统一的定论，但有些学者认为成纤维样滑膜细胞表面存在尿二苷磷酸葡萄糖脱氢酶(Uridine diphosphoglucose dehydrogenase,UDPGD)、Cadherin -11(Cadherin-11)、CD14、CD44、促衰变因子(Decay accelerating factor,DAF/CD55/mAb67)、Thy-1/CD90、血管细胞黏附因子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1/CD106)、波形蛋白等[11-13]。实验选用最常用的成纤维样滑膜细胞鉴定蛋白Vimentin。免疫荧光检测结果显示两种方法得到的P3兔成纤维滑膜细胞表达Vimentin，与袁琴等[14]人报道的相符。滑膜细胞包括巨噬样滑膜细胞、成纤维样滑膜细胞、树突状细胞，其中主要为成纤维样滑膜细胞[15]。原代培养细胞多利用自然纯化法获得较高纯度的细胞，即利用成纤维样滑膜细胞可以贴壁生长、贴壁能力较强、增殖速度较快的特性，通过优势生长、多次消化传代来去除非成纤维型细胞和不健康的成纤维样细胞，从而获得较高纯度的成纤维样滑膜细胞。免疫荧光检测结果发现Vimentin表达强阳性，与其他研究者分离培养得到的成纤维样滑膜细胞Vimentin表达强阳性相符[16，17]，说明通过多次传代可以得到高纯度的兔成纤维样滑膜细胞。

该实验采用悬浮组织块法成功分离培养出兔成纤维样滑膜细胞，与传统的组织块贴壁法相比，悬浮中组织块法具有一定的优势：①操作非常简单，处理时间短，污染机会较少，可在一定程度上克服原代培养较常出现的细菌或真菌污染问题；②此法的核心是将组织块悬浮起来，可以解决组织块贴壁法中组织块贴壁不牢固的问题；③提高珍贵的滑膜组织的利用率。但是在采用悬浮组织块法分离培养兔成纤维滑膜细胞的过程中也有一些注意事项：①取材必须保证无菌操作，取材后立即进行培养；②滑膜组织块的接种量是采用悬浮法成功培养出兔成纤维滑膜细胞的关键，如一个3.5 cm培养皿加入3～4块剪碎的组织块即可；③为区别于组织块贴壁法，一定要在培养皿中加入足够量的培养液使滑膜组织块处于悬浮状态中。

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[收稿2015-12-03修回2016-01-11]

(编辑倪鹏)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.017

作者简介：刘琴(1986年-)，女，硕士，技师，主要从事细胞生物学和分子生物学方面的研究，E-mail:liuqin_0629@163.com。 通讯作者及指导教师：张宜(1965年-)，男，硕士，主任药师，主要从事药学信息方面研究，E-mail:abcd1566@sina.com。

中图分类号R392.33

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-1009-04

Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes using suspended explant culture method

LIU Qin,WANG Li-Ping,CHEN Fang,CHEN Li-Feng,ZHANG Yi.

Department of Medical Experiments,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China

[Abstract]Objective:To isolate rabbit fibroblast-like synoviocytes(FLSs) by suspended explant culture method.Methods: The healthy rabbit joint synovial layers were obtained.The cells were cultured by suspended explant culture method and compared with the explants adherent culture method.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rd passage cells was measured by CCK-8 assay,and the expression of vimentin was tested by immunocytochemistry.Results: The FLS obtained by the two methods exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curve was typical of S type,and the cells highly expressed vimentin.Conclusion: Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes by suspended explant culture method were successfully established.The method was simple and highly efficient.It provided a new method for the isolation of FLS in vitro.

[Key words]Suspended explant culture method;Rabbit fibroblast-like synoviocytes;Isolation;Culture

①解放军广州军区武汉总医院中西医结合科，武汉430070。