IL-17在病毒性心肌炎小鼠中的作用

张晓玲　余宗林　任劲松　刘福川

(四川省达州职业技术学院,达州635001)



IL-17在病毒性心肌炎小鼠中的作用

张晓玲余宗林任劲松①刘福川

(四川省达州职业技术学院,达州635001)

[摘要]目的：研究IL-17对病毒性心肌炎小鼠的作用。方法：随机挑选20只野生型BALB/c小鼠为对照组，20只IL-17A-/-小鼠为IL-17A-/-组，20只L-17A-/-小鼠为IL-17组。每只小鼠腹腔注射柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)建立VMC模型。收集小鼠外周血利用ELISA法检测血清中IL-17水平，利用流式细胞术检测血清中Th17细胞水平。 CVB3处理3 d后，对照组和L-17A-/-组腹腔注射100 μg IgG抗体，IL-17组注射100 μg IL-17mAb。分别于CVB3处理第3、7、14天收集小鼠心肌组织。将小鼠心肌切片并H&E染色进行病理学检查。检测小鼠心肌组织中病毒滴度。利用酶联免疫吸附法检测心肌组织IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的含量。结果：成功构建病毒性心肌炎小鼠。对第14天收集的组织进行分析发现， IL-17组小鼠血清中IL-17和Th17水平均显著低于对照组和IL-17-/-组。对照组小鼠心肌组织损伤程度明显高于IL-17A-/-组和IL-17组，IL-17小鼠心肌组织损伤程度高于IL-17A-/-组。对照组病毒滴度高于IL-17A-/-组和IL-17组，且随着CVB3处理时间增加而增加。在补充IL-17抗体后IL-17组病毒滴度高于IL-17A-/-组。在IL-17-/-组和IL-17组的IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著低于对照组。在补充IL-17抗体后IL-17组IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著高于IL-17-/-组(P<0.05)。结论：IL-17是参与病毒性心肌炎的重要炎症因子，而IL-17缺失可保护小鼠心肌免受病毒性心肌炎损伤。

[关键词]心肌炎；柯萨奇病毒感染；炎症；白细胞介素-17

临床中病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是一种常见的心血管系统疾病，近些年来，其发病率正逐年上升，严重危害病人身体健康[1]。病毒性心肌炎是由于心脏感染柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒等亲心肌病毒导致的心肌炎性疾病，其中以CVB3为主。患者心肌组织出现炎症反应和纤维化，严重者导致扩张型心肌病，出现心律失常、功能衰竭和休克导致患者死亡〔2,3〕。IL-17是由辅助性T淋巴细胞亚群17(Helper T lymphocyte subsets 17，Th17)分泌的特异性细胞因子，促进启动T细胞介导的炎症反应及多种炎症因子的分泌[4]。本文主要研究IL-17对病毒性心肌炎小鼠的作用。

1材料与方法

1.1材料委托上海邦耀生物科技有限公司构建SPF级雄性IL-17A 基因敲除型BALB/c小鼠 (IL-17A-deficient,IL-17A-/-) 。6周龄SPF级雄性野生型BALB/c小鼠(wild-type，WT)购自国家啮齿类实验动物种子中心湖南分中心,许可证号:SCXK (湘)2009-0004。HeLa细胞、Nancy株CVB3为本实验室保存菌种。兔抗小鼠IL-17mAb和IL-23抗体、TNF-α抗体、非特异性IgG抗体购于美国Santa Cruz公司。 TrIzol试剂、PVDF膜购于美国Invitrogen公司。PrimeScript RT reagent kit Perfect Real-Time 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒和ELISA检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1CVB3处理利用HeLa细胞活化增殖CVB3 Nancy株，当细胞病变的程度达75%以上(+++～++++)收获,冻融离心3次之后，收集上清液，检测50%的组织培养感染浓度(TCID50)为107/0.1 ml的Eagle液时用于后续试验，试验所用浓度为102/0.1 ml。

1.2.2动物分组及处理随机挑选20只野生型BALB/c小鼠为对照组，20只IL-17A-/-小鼠为IL-17A-/-组，20只IL-17A-/-小鼠为IL-17组。每只小鼠腹腔注射0.1 ml内含1×102TCID50CVB3的Eagle液建立VMC模型。 CVB3处理3 d后，对照组和L-17A-/-组腹腔注射100 μg IgG抗体，IL-17组注射100 μg IL-17mAb。每两天注射一次。于注射CVB3第3、7、14天，取5只小鼠处死，剥离心脏，沿左室中线切为两半，一半保存于-70℃用于后续试验，一半用10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，用于病理学检查。以摘眼球法取血3 ml，离心，提取上层血清用于IL-17、IL-23和TNF-α及Th17细胞水平测定。

1.2.3心肌病理学检查取收集的心肌组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察心肌病理学改变，每张切片随机取5个高倍视野，计算心肌病理(炎性浸润及坏死)积分，即每个高倍视野中炎性细胞浸润和坏死区域面积与整个视野的面积之比，计分标准：无病变为0分，病变面积<25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，> 75%为4分[5]。

1.2.4病毒滴度测定取保存的心脏组织，液氮研磨， 4℃ 2 000 r/min离心10 min，取上清液，分别稀释10-2～10-6倍，每个稀释梯度的上清液取0.2 ml，加入到HeLa细胞中，每个浓度4个复孔，观察HeLa细胞的病变情况，以漂浮、折光性变强的细胞为病变细胞，病变细胞>50%的孔为病变孔，根据Reed-Muench法测定心肌组织中CVB3的TCID50。

1.2.5ELISA检测小鼠血清中IL-17含量、心肌组织IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的含量通过苯甲磺酰基氟化物(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 将心肌组织匀浆，4℃ 5 000 r /min离心10 min，提取上清液，利用ELISA试剂盒检测上清液中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的浓度，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.6流式细胞分选术(FACS)检测小鼠血清中Th17细胞水平EDTA真空抗凝采血管收集小鼠外周静脉血PBS稀释后，2 000 r/min离心20 min，收集细胞。加入CD4+/CD25+抗体孵育，采用FACS检测小鼠外周血中Th17细胞数目。

2结果

2.1各组小鼠血清中IL-17和Th17细胞水平通过ELISA实验分析小鼠血清中IL-17水平，结果显示，在IL-17-/-组和IL-17组的小鼠血清中IL-17水平均显著低于对照组(P<0.05)，且IL-17组显著低于IL-17-/-组。对照组中Th17比例高于IL-17-/-组和IL-17组，且IL-17-/-组高于IL-17组(P<0.05)。见表1。

2.2各组小鼠状态观察对照组小鼠于感染CVB3第3天开始对刺激反应不敏感或易激怒等症状，并且出现蜷缩屈背、活动减少现象，IL-17A-/-组和IL-17组没有上蜷缩屈背述症状，第14天时，IL-17组出现与对照组类似的症状，而IL-17A-/-组小鼠有轻微上述症状。三组死亡小鼠数目分别为4、0、3只，说明IL-17A-/-组小鼠小鼠存活率高于对照组(χ2=4.443，P=0.035)和IL-17组(χ2=3.243，P=0.072)。

表1各组小鼠血清中IL-17和Th17细胞水平

Tab.1Level of IL-17 and Th17 cells in mice blood serum

GroupsIL-17(pg/ml)Th17cell(%)Controlgroup57.43±8.545.26±1.24IL-17-/-group38.68±3.973.69±0.87IL-17group24.66±2.841.37±0.65

2.3各组小鼠心肌病理学改变见图1。对照组小鼠心肌组织坏死明显，并伴有大量的炎性细胞浸润,心肌组织及血管周围可见纤维化程度增加。IL-17A-/-组小鼠心肌坏死较少，只有少量炎性细胞浸润，IL-17组小鼠心肌组织损伤较为严重，心肌有一定程度的纤维增生。计算各组小鼠心肌病理积分，对照组为2.85±0.53，IL-17A-/-组为1.01±0.26，IL-17组1.58±0.34，其中IL-17A-/-组显著低于对照组和IL-17组(P<0.01)

图1　各组小鼠心肌病理学改变Fig.1　Pathological changes of myocardium in mice

表2各组小鼠CVB3滴度改变

Tab.2Changes of CVB3 titers in mice

TimeControlgroupIL-17-/-groupIL-17group3rdday832±294403±1932)438±1242)7thday10372±12931)694±2631)2)847±2521)2)14thday15385±21951)823±2311)2)11492±21381)2)

Note：Compared 3rd day，1)P<0.05；compared with control group，2)P<0.05.

2.4各组小鼠CVB3滴度及mRNA改变分别于接种CVB3后第3、7、14天检测小鼠心脏组织中CVB3滴度的改变，结果显示，随着接种时间的增加，三组小鼠中CVB3滴度均有所增加。IL-17-/-组和IL-17组CVB3滴度均显著低于对照组(P<0.05)，第3天时，IL-17组小鼠心脏组织中CVB3滴度与IL-17-/-组无显著差异(P>0.05)，但第7天和第14天时，CVB3滴度均显著高于IL-17-/-组组(P<0.05)。见表2。

2.5各组小鼠心脏组织中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平利用ELISA试剂盒检测病毒性心肌炎小鼠心脏组织中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平，结果显示，在IL-17-/-组和IL-17组的IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著低于对照组。第3天时，IL-17组和IL-17-/-组的IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平没有显著差异，但是第7天和第14天时，IL-17组IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著高于IL-17-/-组(P<0.05)。见表3。

3讨论

病毒性心肌炎是临床中一种主要柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)感染心脏组织导致心肌炎症反应的疾病，部分患者可发生严重心律失常、心衰以及心源性休克而死亡，少数患者可发展为迁延性或慢性病毒性心肌炎，最终转化为扩张型心肌病。此外病毒性心肌炎也是青壮年猝死的主要因素之一。病毒性心肌炎是种复杂的炎症反应，多种细胞因子参与其中[6]。

表3各组小鼠心肌细胞中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平的改变(pg/ml)

Tab.3Change of IL-17,IL-23,IL-6 and TNF-α level in mice(pg/ml)

IL-17IL-23IL-6TNF-αControlgroup3rdday89.33±9.36841.35±86.3740.32±5.649.39±0.447thday63.23±3.28744.53±57.7633.27±3.406.47±1.1614thday42.99±2.42632.85±55.3922.46±2.264.84±1.38IL-17-/-group3rdday51.38±8.29462.59±72.3330.44±4.365.22±0.217thday37.23±3.48246.48±64.4618.46±2.753.72±0.4514thday29.73±2.52174.23±38.218.47±2.352.12±0.24IL-17group3rdday71.43±9.30447.57±65.4334.65±4.865.29±0.247thday46.22±5.48316.54±54.4723.43±2.854.75±0.3214thday29.74±2.45232.74±42.4313.69±2.743.68±1.23

目前研究发现，除了经典的Th1/Th2 细胞参与介导病毒性心肌炎造成的免疫损伤，辅助性 T 淋巴细胞亚群 17(Th17)细胞也在病毒性心肌炎中发挥着重要的作用。Th17主要通过调节多种炎症相关因子水平，影响基质金属蛋白酶的异常表达，进而导致组织损伤破坏和炎性细胞浸润，促进组织炎症反应[7]。人类 Th17 细胞亚群主要由IL-1β和 IL-23 诱导分化产生，Th17细胞可以分泌IL-17(IL-17A、IL-17F)、IL-6、IL-23和 TNF-α等多种细胞因子，其中IL-6和IL-23又可以促进Th17激活并分泌IL-17。Th17/IL-17 与类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病和炎性疾病有关，IL-17A 基因缺失诱导炎症因子IFN-γ的表达，并降低IL-1β、IL-6 和 TNF-α的表达水平[8]。另外，研究发现在病毒性心肌炎患者体内Th17 细胞和 IL-17 明显增多，说明IL-17可能参与了病毒性心肌炎的炎症反应。因此，IL-17在病毒性心肌炎中的意义亟待研究。

本文为了研究IL-17在病毒性心肌炎中的作用，我们利用野生BALB/c小鼠和IL-17-/-小鼠构建了病毒性心肌炎模型小鼠，在建模结束后检测小鼠血清中IL-17和Th17水平发现，IL-17组小鼠血清中IL-17和Th17水平均显著低于对照组和IL-17-/-组。在CVB3处理3 d后小鼠出现活动减少，对刺激反应不敏感或易激怒等症状，根据前人文献，说明病毒性心肌炎小鼠已经初步构建成功。饲养14 d以后，对各组小鼠的心脏组织进行切片、H&E染色发现，对照组小鼠心肌组织坏死明显，并伴有大量的炎性细胞浸润,心肌纤维化程度增加。而IL-17A-/-组小鼠心肌坏死程度明显较轻，只有少量炎性细胞浸润，IL-17组小鼠心肌组织损伤较为严重，心肌有一定程度的纤维增生。并且IL-17A-/-组心肌病理积分显著低于对照组和IL-17组(P<0.01)，说明IL-17A缺失在一定程度上保护小鼠免受病毒性心肌炎造成的损伤。这点通过检测 CVB3病毒滴度也得到了同样的炎症。分别检测CVB3处理第3、7、14天后小鼠心脏组织中CVB3病毒滴度，结果显示， IL-17-/-组的CVB3滴度显著低于对照组和IL-17组(P<0.05)。第3天时，IL-17组小鼠心脏组织中CVB3滴度与IL-17-/-组无显著差异(P>0.05)，但注射IL-17单克隆抗体后，于第7天和第14天检测CVB3滴度时，IL-17组的病毒滴度显著高于IL-17-/-组，说明小鼠体内补充IL-17后，引发病毒性心肌炎对小鼠心脏组织的损伤。

蔡泽民等[9]发现IL-17/IL-23免疫轴在病毒性心肌炎小鼠中的含量显著高于正常小鼠。而本文通过检测病毒性心肌炎小鼠心脏组织中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平，结果显示，随着CVB3处理天数的增加，IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均有所降低，这可能是由于心肌损伤程度增加造成的。在IL-17-/-组和IL-17组中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著低于对照组，说明IL-17的缺失可以降低病毒性心肌炎引发的炎症反应。值得注意的是，在补充IL-17抗体第7天和第14天后，IL-17组IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α水平均显著高于IL-17-/-组(P<0.05)相对应的IL-17组在第14天时，心肌损伤程度和纤维化程度也明显高于IL-17-/-组。以上结果说明，IL-17缺失减弱了病毒性心肌炎的炎症反应。

总之，本文通过对比IL-17缺失小鼠及给IL-17缺失小鼠补充IL-17抗体的情况下分析IL-17对小鼠病毒性心肌炎的作用，结果显示IL-17是参与病毒性心肌炎的重要炎症因子之一，而IL-17缺失对小鼠心肌具有保护作用。

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[收稿2015-09-15]

(编辑张晓舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.010

作者简介：张晓玲(1971年-)，女，副教授,主要从事免疫学、医学微生物学、临床检验方面研究，E-mail:zhanxiaolin_zxl@sina.com。

通讯作者及指导教师：任劲松(1971年-)，男，副主任医师，主要从事口腔医学方面的研究。

中图分类号R725.4

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)07-0979-04

Function of IL-17 in viral myocarditis mice

ZHANG Xiao-Ling，YU Zong-Lin，REN Jin-Song，LIU Fu-Chuan.

Dazhou Vocational and Technical College in Sichuan Province,Dazhou 635001，China

[Abstract]Objective:To study the effect of IL-17 on viral myocarditis in mice.Methods: We randomly selected 20 wild type BALB/c mice as the control group,20 IL-17A-/-mice for IL-17A-/-group,20 IL-17A-/-mice for IL-17 group.Each mouse had intraperitoneal injection of Coxsackie virus B3 (Coxsackie virus B3,CVB3) to construct VMC model.The serum levels of IL-17 were detected by ELISA method,and Th17 cells were detected by flow cytometry.After 3 days of treatment with CVB3,100 μg IgG antibody was injected intraperitoneally in control group and L-17A-/-group,and 100 μg IL-17mAb was injected with IL-17 group.Mice myocardium was collected at 3rd,7th and 14th days,respectively,after CVB3 treatment.Pathological examination was carried out on the myocardial sections of mice and stained with H&E.Virus titer in mouse myocardium was examined.The contents of TNF-α,IL-6,IL-23 and IL-17 in myocardial tissue were detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results: We successfully constructed the model of mice with viral myocarditis.The levels of Th17 and IL-17 in serum of IL-17 group were significantly lower than those in control group and IL-17-/-group.On the fourteenth day after CVB3 treatment,the degree of myocardial tissue damage in the control group was significantly higher than that in the IL-17A-/-group and the IL-17 group(P< 0.05),the degree of myocardial injury in IL-17 mice was higher than that in the IL-17A-/-group.The virus titer of the control group was higher than that of IL-17A-/-group and IL-17 group,and the control group was increased with the increase of CVB3 treatment phase (P< 0.05).After the IL-17mAb was injected,the virus titer of IL-17 group was higher than that of IL-17A-/-group.The levels of IL-17,IL-23,IL-6 and TNF-α in IL-17-/-group and IL-17 group were significantly lower than those in control group.The levels of IL-17,IL-23,IL-6 and TNF-α in IL-17 group were significantly higher than those in IL-17-/-group (P< 0.05).Conclusion: IL-17 is an important inflammatory factor in viral myocarditis,and IL-17 deletion can protect myocardium from viral myocarditis in mice.

[Key words]Myocarditis;Coxsackie virus infection;Inflammation;Interleukin-17

①达州市中心医院,达州635001。