UPLC-MS/MS 测定减肥类中药制剂及保健食品中的4种非法添加成分

涂凤莲汪元符

（1新建区中医医院，江西 南昌 330100；2南昌市食品药品检验所，330038）

UPLC-MS/MS 测定减肥类中药制剂及保健食品中的4种非法添加成分

涂凤莲1汪元符2

（1新建区中医医院，江西 南昌 330100；2南昌市食品药品检验所，330038）

目的：针对减肥类中药制剂及保健食品，建立了可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明等4种成分的超高效液相色谱-质谱/质谱联用的检测方法。方法：色谱柱为Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm×2.00 mm，3 μm）；柱温为35℃；流动相为10 mmol/L乙酸铵（以乙酸调节pH值至4.0）及乙腈，梯度洗脱；流速为0.2 mL/min；以优化后的质谱参数采集信号。结果：各成分检出限浓度为0.1～ 0.2 ng/mL；定量限浓度为0.3～ 0.5 ng/mL；线性范围为各成分定量限～ 100 ng/mL；在线性范围内相关系数均在0.99以上；平均加样回收率为94.2%～ 101.5%。结论：本方法简便，快速，准确，灵敏度高，专属性好，能用于减肥类中药制剂及保健食品中非法添加的快速检测。

超高效液相色谱-质谱/质谱联用；酚酞；西布曲明；N-单去甲基西布曲明；N，N-双去甲基西布曲明；非法添加

在日常检测工作实践中，减肥类中药制剂及保健食品非法添加违禁药物成分的情况时有发生。基于加强检测能力，提高检测方法的灵敏度、准确度、精确度的原因，本实验室建立了有效的超高效液相色谱-质谱/质谱联用法（UPLC-MS/MS），在定性确认的同时测定可能非法添加的酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明等4种成分的含量，能够满足平时的监督检验需要。

1仪器、试剂与材料

AB Sciex 4000 Qtrap质谱，ekspert ultraLC100高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，昆山KQ-300DB型数控超声波清洗器，TG16-WS台式高速离心机（湘仪离心机），Millipore超纯水系统。

甲醇（色谱纯，Merck）、乙腈（色谱纯，Merck），冰乙酸（色谱纯，麦克林A801303-500 mL），乙酸铵（优级纯，麦克林A800998-500 g）。

对照品：酚酞（100091-199601）、盐酸西布曲明（100624-200401）、盐酸 N-单去甲基西布曲明（520002-201301）、盐酸N，N-双去甲基西布曲明（520001-201301），均为中国食品药品检定研究院提供。

样品：购自流通或医疗机构。中药制剂8批：体美减肥胶囊（规格：0.3 g，批号：130607），福瑞堂轻身减肥胶囊（规格：0.35 g，批号：131005），靓尔娜轻身减肥片（规格：108片，批号：130722），永孜堂降脂减肥片（规格：36片，批号：130301），堂旨舒降脂减肥片（规格：72片，批号：130722），形美轻身减肥片（规格：48片，批号：131015），同仁堂轻身消胖丸（规格：240粒，每100粒约重15 g，批号：130705），中一牌防风通圣丸（规格：6 g，批号：130701）。保健食品13批：轻身乐减肥胶囊（规格：0.20 g，批号：14070301），蜀宝减肥胶囊（规格：200 mg，批号：20150310），纽斯葆婷采减肥靓颜胶囊（规格：0.3 g，批号：FC158），美澳健秀中秀减肥胶囊（规格：0.4 g，批号：15202002），金奥力绿茶肉碱胶囊（规格：0.42 g，批号：14041901），康乃馨壳聚糖左旋肉碱荷叶片（0.7 g，批号：150401），奥斯莱康惠普生纤纤片（规格：600 mg，批号：20150301），汤臣倍健左旋肉碱茶多酚荷叶片（规格：1 220 mg，批号：20140514A），纽斯葆绿荷片（规格：0.4 g，批号：EC678），碧生源减肥茶（规格：2.5 g，批号：04150106），瑞德梦减肥茶（规格：2.5 g，批号：140106），半生缘天信减肥茶（规格：3 g，批号：141018），郑氏膳食素（规格：250 mg/粒，批号：20141010）。

2方法与结果

2.1高效液相色谱分析条件

分析柱：Phenomenex Luna C18（2）100A（150 mm× 2.00 mm，3 μm）；柱温：35℃；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL。流动相：A为10 mmol/L乙酸铵以乙酸调节pH值至4.0，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

表1　梯度洗脱程序

2.2质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子模式（ESI+）。扫描模式：多重反应监测。扫描范围：50～ 600 Da。气帘气压力：25 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：5 500 V。离子源温度：500℃。雾化气压力：55 Pa。辅助气压力：50 Pa。界面加热状态：开启。离子对选择见表2。

2.3对照品溶液的配制

取酚酞、盐酸西布曲明、盐酸N-单去甲基西布曲明、盐酸N，N-双去甲基西布曲明对照品各约10 mg，精密称定，以甲醇制成每1 mL中各含酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明1 mg的溶液作为对照品储备液。精密量取对照品储备溶液 1 mL，以50%甲醇，制成各含200 ng/mL的溶液，作为对照品使用液。对照品使用液以50%甲醇等比稀释，可得到各含 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/mL的标准系列溶液。

表2　质谱分析

2.4供试品溶液的配制

将8批分别为丸剂、片剂、胶囊剂（取内容物）的中药制剂样品及12批分别为胶囊（取内容物）、片、茶的保健食品样品研细，各取约 0.50 g，精密称定，置 100 mL量瓶中，加入甲醇约 80 mL，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）15 min，放冷至室温，再加甲醇至刻度定容，摇匀，以10 000 r/min离心10 min后，取上清液以 50%甲醇溶液稀释10～ 100倍，经0.2 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液测定。

2.5对照品（1 ng/mL）定量离子对提取质谱图

见图1～4。

图1　酚酞（1 ng/mL）离子对（319.1/225.1）提取质谱

图2　西布曲明（1 ng/mL）离子对（280.2/139.0）提取质谱

图3　N-单去甲基西布曲明（1 ng/mL）离子对（266.1/125.3）提取质谱

图4　N，N-双去甲基西布曲明（1 ng/mL）离子对（252.2/125.0）提取质谱

2.6定性确认

采用保留时间与对照品相一致，且定性与定量离子对相对离子丰度比应满足表3要求，判为检出。

表3　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差　（%）

2.7线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”，“2.2”项下的质谱条件，以“2.3”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/mL）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度（ng/mL）为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度（ng/mL）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。结果见表5。

2.8精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/mL的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表6。

2.9稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/mL的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24小时分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表7。

表4　对照品试验结果

表5　线性关系及检出限、定量限考察结果

表6　精密度试验结果

表7　稳定性试验结果

2.10回收率试验

取中药制剂阴性样品：丸剂（同仁堂轻身消胖丸）、片剂（靓尔娜轻身减肥片）、胶囊剂（体美减肥胶囊）各1批，取保健食品阴性样品：茶（碧生源减肥茶）、片（康乃馨壳聚糖左旋肉碱荷叶片）、胶囊（轻身乐减肥胶囊）各1批，按“2.4”项下平行称样各 3份，分别加入0.05，0.5，5 mL每 1 mL中各含1 mg的对照品储备液，置100 mL量瓶中，加入甲醇约80 mL，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）15 min，放冷至室温，再加甲醇至刻度定容，摇匀，以10 000 r/min离心10 min后，取上清液，以50%甲醇溶液稀释100倍后，经0.2 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液测定。3份平行样最终加标浓度分别为5，50，100 ng/mL。以5次平行测定结果的均值与加标浓度相比较，回收率见表8～9。

结果不同剂型各组分高、中、低三个浓度的回收率均在94.2%～ 101.5%之间。

2.11样品测定结果

检测了8批次中药制剂及13批次保健食品，结果20批次为阴性，1批次为阳性。郑氏膳食素（规格：250 mg/粒，批号：20141010）检出含西布曲明20 mg/粒。

表8　中药制剂中加样回收试验结果

表9　保健食品中加样回收试验结果

3讨论

3.1流动相的选择

试用了醋酸盐缓冲液-甲醇及醋酸盐缓冲液-乙腈系统，证实以醋酸盐缓冲液-乙腈系统离子化效率高，离子强度大，检测灵敏度高。为提高检测限，采用梯度洗脱的方式。比较了不同pH值的流动相，结果在pH值为4.0时各成分分离较好。

3.2质谱条件的优化

根据试验结果，选用灵敏度高的一种方法。选用灵敏度最高的一组离子对作为定量离子对，再选择灵敏度次高的一组离子对作为定性离子对。

3.3与现行法规方法的比较

现行法规标准［1］所列的“高效液相色谱-质谱联用法”采用保留时间、一级质谱图、二级质谱图相一致，作为阳性结果。而要得到特征的二级质谱图需一定的样品浓度，经试验需达到500 ng/mL以上。由于质谱的高灵敏度极易污染的特性，进样前样品需经净化处理并以较大倍数稀释，不利于检出。采用本法，色谱条件较优，各成分能基线分离，灵敏度高，0.2 ng/mL即能检出，0.5 ng/mL即能定量。且酚酞、西布曲明、N-单去甲基西布曲明、N，N-双去甲基西布曲明是日常工作中经常需要检测的参数。因此本法为简便，快速，准确，灵敏度高，专属性好，且能高通量操作的实用方法。

3.4与文献方法的比较

文献［2-3］均只建立了定性的方法，而没有定量的方法。文献［4］虽然建立了定量的方法，但还有不完善之处。①文献［4］中色谱洗脱采用高乙腈强洗脱，色谱过程仅为5 min，所有的检出化学成分均在3 min左右出峰，也就是在此时间之后所有的化学成分均流出，几乎无保留，没有充分利用到液相色谱的分离功能来分析化学物质；而本文采用较好的梯度洗脱，保留时间合理，化学物质分离充分，较好地发挥了液质联用中液相色谱的分离特点与质谱检测器高灵敏度与选择性的强强结合，结果理想。②文献［4］中采用浓度范围0.04～ 40 μg/mL的标准系列溶液来考察线性关系及检出限、定量限，采用浓度10 μg/mL的标准溶液作精密度、稳定性考察，进样浓度偏高；质谱检测器是高灵敏度检测器，进样浓度偏高会造成过饱和与残留影响，通常采样浓度为 ng/mL；本文采用0.1～ 100 ng/mL的标准系列溶液，以10.0 ng/mL的浓度进行精密度、稳定性试验，则较为合理。

［1］国家食品药品监督管理局.药品检验补充检验方法和检验项目批准件［S］.2012005，2012-08-01.

［2］胡青，张甦，简龙海，等.LC-MS法测定减肥类保健食品中非法添加的西布曲明及其衍生物［J］.中国卫生检验杂志，2011，21 （8）：1861-1862.

［3］ 沈国芳，朱建，裘一婧.UPLC-MS/MS检测减肥类保健食品中的西布曲明及其去甲基衍生物［J］.中国药学杂志，2011，46 （20）：1609-1611.

［4］ 朱健，裘一婧，沈国芳.UPLC-MS/MS法快速检测减肥类保健品中13种非法添加化学成分［J］.中草药，2014，45（4）：509-515.

［5］ 王静文，曹进，王钢力，等.保健食品中非法添加药物检测技术研究进展［J］.药物分析杂志，2014，34（1）：1-11.

［6］朱峰，阮丽萍，马永建，等.超高效液相色谱-串联质谱联用法同时检测降糖类和减肥类保健品中20种非法添加的化学降糖药物［J］.色谱，2014，32（1）：13-20.

［7］王静文，黄湘鹭，曹进，等.超高效液相色谱法同时测定减肥类保健食品中非法添加的25种药物［J］.色谱，2014，32（2）：151-156.

［8］ 黄芳，吴惠勤，黄晓兰，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定保健品中非法添加的六种减肥化学品［J］.分析测试学报，2013，32（6）：699-704.

［9］ 马微，王海波，马强，等.减肥保健食品中非法添加酚酞和西布曲明的同时检测 ［J］.食品科学，2010，31（4）：156-160.

［10］ 张斌，姚家忠，贾昌平，等.减肥类保健食品中非法添加的8种化学药物的筛查与测定［J］.中国执业药师，2015，12（3）：22-27，56.

［11］黄诺嘉，杨文红，黄奕滨.减肥类中成药、保健食品、食品中非法添加酚酞、西布曲明等化学成分的快筛检测方法研究［J］.食品与药品，2011，13（3）：114-117.

Determination of Four Components Illegally Mixed into Traditional Chinese Medicines and Healthy Foods for Antiobesity by UPLC-MS/MS

Tu Fenglian1，Wang Yuanfu2（1 Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjian District，Jiangxi Nanchang 330100，China；2 Nanchang Institute for Food and Drug Control，330038）

Objective：To develop a UPLC-MS/MS method for determination offour components（phenolphthalein，sibutratmine，N-Monodesmethylsibutramine and N，N-Didesmethylsibutramine）illegally mixed into traditional Chinese medicines and healthy foods for antiobesity.Methods：Phenomenex Luna C18（2）100A column （150 mm×2.00 mm，3 μm）was used at a column temperature of 35℃，serving 10 mmol/L ammonium acetate（pH 4.0）-acetonitrile as a mobile phase.Gradient elution was adopted at a flow rate of 0.2 mL/min.Signals were collected by optimized MS/MS method.Results：The detection limit of this method was 0.1～ 0.2 ng/mL，while the quantitative detection limit was 0.3～ 0.5 g/mL，and the linear range was the quantitative detection limit ～100 ng/mL.All the correlation coefficients within the linear range was more than 0.99，and the average spike recovery was 94.2% ～ 101.5%.Conclusion：This method is simple，rapid，accurate，and of high sensitivity and high specificity，which may be used for the rapid determination of illegal additives in the traditional Chinese medicines and healthy foods for antiobesity.

UPLC-MS/MS；Phenolphthalein；Sibutratmine；N-Monodesmethylsibutramine；N，N-Didesmethylsibutramine；Illegal Additives

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.06.005

涂凤莲，女，主管药师。研究方向：临床药学、医院药学。E-mail：wanngels@sina.com

汪元符，男，主管药师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。通讯作者E-mail：wanngel@126.com

2016-03-08）