HPLC法测定富马酸二甲酯中的有关物质

邓双炳　石　岩　韩　琳　涂　涛*（.深圳万和制药有限公司　深圳　58057；.中国食品药品检定研究院　北京　00050；.北京博爱旺康医药科技有限公司　北京　0076）

HPLC法测定富马酸二甲酯中的有关物质

邓双炳1石岩2韩琳3涂涛3*（1.深圳万和制药有限公司深圳518057；2.中国食品药品检定研究院北京100050；3.北京博爱旺康医药科技有限公司北京100176）

目的：建立HPLC法测定富马酸二甲酯中的有关物质。方法：采用C18色谱柱，以乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为210nm。结果：富马酸二甲酯、杂质A、杂质B在0.2～2.0μg·mL-1范围内线性关系良好；杂质A和杂质B的平均回收率分别为98.3%和96.7%，RSD分别为2.3%和2.7%。结论：本方法的专属性、准确度、灵敏度等符合要求，可用于测定富马酸二甲酯中的有关物质。

富马酸二甲酯 有关物质 高效液相色谱 测定

2013年3月，美国Biogen公司把富马酸二甲酯（1）开发成治疗多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）新药（商品名：Tecfidera）获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，随后获得欧洲药物管理局（EMA）的批准，目前在国内还没有获得批准。分析合成工艺路线，它可能存在的有关物质主要有富马酸即为杂质A（2）、富马酸单甲酯即为杂质B（3），马来酸即为杂质C（4）、马来酸二甲酯即为杂质D（5）。本研究建立HPLC法用于测定1中的有关物质，经方法学验证，专属性好、灵敏度高、准确度好。

1仪器与试药

2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。1工作对照品（自制，含量99.7%，批号DMF-20140501）；2对照品（中国食品药品检定研究院，含量99.4%，批号111541-201102）；3工作对照品（自制，含量97.2%，批号DMF-B-20140601）；4对照品（中国食品药品检定研究院，含量99.7%，批号190015-201302）；5工作对照品（自制，含量98.8%，批号DMF-D-20140601）。甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾为分析纯，水为纯化水。

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱为博纳艾杰尔的ASB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为1mL/min；进样量10μL。

表1梯度洗脱程序

2.2溶液的配制：供试品溶液：取1原料药适量，精密称定，加甲醇适量，超声使溶解，用流动相稀释制成1mg·mL-1的溶液。对照溶液：取1工作对照品适量，精密称定，加甲醇适量，超声使溶解，用流动相稀释制成1μg·mL-1的溶液。系统适用性试验溶液：取1、2、3、4、5对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成1的浓度约为1mg·mL-1，2、3、4、5的浓度均约为0.02mg·mL-1的混合溶液。

2.3方法学研究

2.3.1系统适用性试验：取“2.2”项下的系统适用性试验溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱图，各峰的分离度均不低于1.5（图1）。

2.3.2专属性

（1）已知杂质的分离度试验：同系统适用性试验。

（2）溶剂干扰试验：精密量取甲醇10μL注入液相色谱仪，结果无干扰。

（3）粗品：取1粗品10mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后进样测定，结果显示仅存在2和3。

（4）降解试验：取1原料药10mg，5份，置10mL量瓶中，分别进行高温、强酸、强碱、氧化、光照的破坏试验，用甲醇稀释至刻度，摇匀后分别进样测定，结果表明各破坏条件下的降解产物主要为2、3，其他降解杂质均与1、2、3、4、5分离良好。

综上，方法的专属性良好；根据粗品和降解试验结果，仅对2、3按《中国药典》［1］要求进行定量的系统方法学研究，而对4、5仅进行限度方法学研究（检测限、专属性、耐用性）。

2.3.3检测限与定量限：精密称取1、2、3、4、5对照品适量，用甲醇分别制成10μg·mL-1的对照品贮备液；分别用甲醇逐级稀释，当信噪比约为10时计算为定量限，当信噪比约为3时计算为检测限。结果显示最低定量限分别为53.5、34.7、144.5、150.5、45.5ng·mL-1，最低检测限分别为16.2、10.5、43.8、45.6、13.8ng·mL-1。

2.3.4线性与范围：精密量取“2.3.3”项下的1、2、3对照品贮备液，用甲醇稀释成系列浓度（0.2、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0μg·mL-1）的溶液，分别进样测定，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。1：A=161473.200C+11.7363，r=0.9998；2：A=16997.402C+35.0756，r=0.9992；3：A=57669.9220C－1.7478，r=0.9999。1、2、3在0.2～2.0μg·mL-1范围内线性关系良好。按标准曲线斜率法计算2、3的校正因子，分别为0.95、2.8。

2.3.5精密度

（1）进样精密度：取“2.2”项下的对照溶液10μL，进样5次，记录色谱图，计算峰面积的RSD为1.5%。进样精密度良好。

（2）重复性：取1原料药10mg，置10mL量瓶中，精密量取“2.3.3”项下的2、3对照品贮备液1mL，同法配制6份供试品溶液；按“2.2”项下配制对照溶液；分别进样测定，计算2、3含量的RSD分别为1.8%、2.5%。方法的重复性良好。

（3）中间精密度：与重复性试验于不同日期、不同人员、不同仪器，同法测得6个结果，与重复性试验结果合并计算RSD为2.0%、2.8%。方法的中间精密度良好。

2.3.6准确度：取1原料药10mg，9份，分别置10mL量瓶中，每3份为一组，每组分别精密加入“2.3.3”项下的2对照品贮备液0.5、1.0、1.5mL，精密加入3对照品贮备液0.2、0.4、0.6mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀。分别进样测定，计算得2和3的平均回收率（n=9）分别为98.3%和96.7%，RSD分别为2.3%和2.7%。方法的准确度良好。

2.3.7耐用性

（1）溶液稳定性：取系统适用性试验溶液分别于0、2、4、8、16、24h依法测定，结果主峰面积RSD为0.52%，各杂质峰面积RSD均不大于10%，表明溶液在24h内稳定。

（2）色谱参数：在流速（±0.2mL/min）、波长（±2nm）、柱温（± 5℃）、流动相初始比例（±1%）、色谱柱（不同批号）略有改变的条件下，分别取系统适用性试验溶液、供试品溶液（加入各杂质贮备液使含量约为0.1%）、对照溶液进样测定；在各条件下的系统适用性试验溶液色谱图最小分离度均不小于1.5；各条件下的各杂质含量数据（n=6）的RSD均不大于10%。方法的耐用性良好。

2.4样品测定：取三批样品（批号140801、140802、140803）分别按“2.2”项下配制供试品溶液，进样测定，另取对照溶液、系统适用性试验溶液同时测定，结果三批样品中均未检出2、4、5，检出3的含量分别为0.05%、0.08%、0.06%。

3讨论

波长的选择：将1、2、3、4、5对照品贮备液分别进行波长扫描，结果表明在210nm波长处均有较大吸收，并参考FDA的审批报告披露信息［2］，选择210nm作为检测波长。

溶剂的选择：1为酯类遇水容易水解，故溶剂采用乙腈、甲醇，但2、4用乙腈溶解后峰型分叉或拖尾，故最终选择甲醇为溶剂。

［1］国家药典委员会，中华人民共和国药典［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩⅨA.

［2］FDA.Chemistry Review（s）［EB/OL］.［2014-06-15］.

Determination of Related Compound in Dimethyl Fumarate by HPLC

Deng Shuangbing1Shi Yan2Han Lin3Tu Tao3*（1.Shenzhen WanHe Pharmaceutical Co.，Ltd，Guangdong 518057，China；2.National Insitutes for Food and Drug Control，Beijing 100500，China；3.Beijing Bio-welcome Medical Technology CO.，Limited，Beijing100176，China）

Objective：The HPLC method was improved for the determination of the related compounds in dimethylfumarate.Method：A C18column was used；Used acetonitrile as mobile phase A，0.1%phosphoric acid as mobile phase B，and gradient eluted.The detection wavelength was 210nm.Results：The calibration curves for dimethyl fumarate and its related compounds A and B were linear in the range of 0.2～3μg·mL-1.The average recoveries of related compounds A and B were 98.3%（RSD=2.3%）and 96.7%（RSD=2.7%）.Conclusion：The specificity，accuracy，sensitivity，etc.meet the requirements for the determination of dimethyl fumarate related compound.

Dimethyl fumarate Related compound HPLC Determination

R927

A

1672-8351（2016）08-0006-02