益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病氧化应激Mn-SOD、MDA影响实验研究

梁　薇，谭年花，潘子怡，谢毅强，韦　祎（海南医学院，海南海口571199）

益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病氧化应激Mn-SOD、MDA影响实验研究

梁薇，谭年花，潘子怡，谢毅强，韦祎
（海南医学院，海南海口571199）

目的：探讨不同浓度益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病大鼠的抗氧化应激作用。方法：SD大鼠高糖高脂饮食联合STZ腹腔注射造模4 w。随机分为空白组、益智仁-乌药醚提取物高、中、低剂量组，西药组、模型组6组，每组10只。给药4 w后用ELISA法检测各组大鼠Mn-SOD，TBA法检测MDA。结果：与模型组比较，益智仁-乌药醚提取物各剂量组及西药组Mn-SOD明显升高（P＜0.01），MDA明显降低（P＜0.05，P＜0.01），且作用与西药缬沙坦相当。结论：益智仁-乌药醚提取物可能通过升高SOD，降低MDA防治糖尿病肾病的发生发展，并延缓了糖尿病肾病的进展。

糖尿病肾病；益智仁-乌药醚提取物；Mn-SOD；MDA

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要并发症之一，也是糖尿病常见的难治性并发症，临床表现为蛋白尿、高血压、肾功能进行性下降，终末期时出现尿毒症症状。调查结果显示，我国糖尿病的患病率为9.7%，其中20%～40%会发生糖尿病肾病，由DN引发的终末期肾病（ESRD）是威胁糖尿病患者生命的主要原因，最终有5%～10%的糖尿病患者死于肾病。中医药目前已成为安全有效的治疗DN的途径之一。

“药对”（或称对药）是一种相对固定的组方单位，也是复方配伍中最基本的单位。故本实验通过检测锰-超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、丙二醛（MDA）的方法，探讨不同浓度益智仁-乌药醚提取物对STZ造模的糖尿病肾病大鼠的抗氧化应激作用，进而以确定其疗效性。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SD大鼠，SPF级，雌雄各半，8 w龄，体重（180±20）g。长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK（湘）2009-0012。适应性饲养1 w后，无不良反应即进入实验。

1.1.2试剂与仪器腺嘌呤、缬沙坦、大鼠SOD ELISA检测试剂盒、大鼠TBA检测试剂盒；离心机；AF240电子天平（中国瑞士梅勒公司）；酶标仪（上海闪普）。干燥合格的益智种仁和乌药块根。

1.2方法

1.2.1药物的提取益智、乌药按1∶1比例进行常规水煎3次，收集浓缩液得干浸膏；另取水煎液依次用石油醚（60℃～90℃）、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取，分离各层，并分别减压回收溶剂，即得各部位。取石油醚部位浸膏，将其配制成含5%Twen-80的稳定的混悬液备用。并根据该部位的出膏率，制备成折合1g生药/mL的药液备用。

1.2.2造模50只SD大鼠高糖高脂饮食联合40 mg/kg的STZ腹腔注射，然后分别给予高能量饮食（包括高糖、高脂、高糖高脂饮食）饲喂4 w诱发大鼠胰岛素抵抗，解剖部分DN模型可发现大鼠早期肾脏病变为细胞外基质积聚，出现系膜细胞增生、细胞外基质增多、系膜区明显增宽，以此确定造模成功。另取10只作为空白组，正常喂养。

1.2.3分组及给药造模成功的SD大鼠给药处理喂养8 w，随机分为益智仁-乌药高剂量组、中剂量组、低剂量组，西药组、模型组5组，每组10只。低剂量、中剂量、高剂量（100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg）分别给予益智仁-乌药石油醚提取物，西药组缬沙坦20 mg/kg。另设空白组，不给予干预。给药4 w后，取血清备用。实验期间，小鼠在层流柜中饲养，所有器具及食物均消毒，无菌操作。小鼠自由进食、进水，保持垫料干燥，12h交替照明。每2 w测体重、血糖。

1.2.4检测指标实验结束后处死动物，处死前12h禁食不禁水，以葡萄糖氧化酶法鼠尾毛细血管取血测空腹血糖（FBG）后，按2 mL/kg体重腹腔注射8%异戊巴比妥钠麻醉后固定四肢，取腹部正中切口，在腹主动脉插入无菌空针采血3～5 mL，血液标本以3 000 rpm离心15min，分离血清，取上清液，-20℃保存待测肾功等。

用ELISA法按说明书检测SOD。实验操作步骤：称取植物组织0.5g先加入2.5 mL PBS，研磨匀浆后，再加入2.5 mL PBS混匀，4℃下10 000 r/min离心15min上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。取10 mL小烧杯7只，3只测定样品，4只作为对照，将上述试剂混匀后，1只对照烧杯置于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于4 000 lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长），最后在560 nm处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。

蛋白含量的测定：步骤1的上清液经适当稀释后用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量。

TBA法检测MDA。取0.5 mL肾组织剪碎匀浆液于10 mL试管，加入2 mL 0.6%的TBA。保鲜膜封口，扎一小孔沸水浴15min，取出后流水冷却，以10 000 rpm离心10min，取上清液测450 nm，532 nm和600 nm的吸光值。换算公式：C （μmol/L）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450

1.3统计学方法

2结果

2.1益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病大鼠Mn-SOD的影响

与空白组相比，模型组大鼠Mn-SOD含量明显下降（P＜0.01）；与模型组比较，其余各组大鼠的Mn-SOD均显著升高（P＜0.05，P＜0.01），高剂量组与西药组的效果接近。结果见表1。

2.2益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病MDA的影响

与空白组相比，模型组大鼠MDA含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，其余各组大鼠的MDA都降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1　益智仁-乌药醚对糖尿病肾病Mn-SOD，MDA的影响　（μmol/L，±s）

表1　益智仁-乌药醚对糖尿病肾病Mn-SOD，MDA的影响　（μmol/L，±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

组别　Mn-SOD　MDA西药组　65.40±5.432）　8.45±0.272）模型组　45.29±4.581）　8.94±0.521）益智仁-乌药高剂量　69.24±5.123）　8.17±0.353）益智仁-乌药中剂量　62.35±4.583）　8.51±0.292）益智仁-乌药低剂量　55.23±4.442）　8.71±0.422）

3讨论

糖尿病肾病是与长期糖尿病相关的进行性肾脏损伤，病变累及肾小球、肾小动脉、肾小管及间质组织，临床上以持续蛋白尿为主要特征，伴有肾小球滤过率进行性下降，导致终末期肾病，最终需要透析或肾脏移植［1］。益智仁性温，味辛，具有暖肾固精缩尿、温脾止泻摄唾的功能，化学成分多样，其神经保护作用、抗炎作用和抗老年痴呆作用是近年来的研究热点［2］。前期研究证实，石油醚部位是益智仁抗糖尿病肾病的有效部位［3］。乌药为樟科植物，性味辛温，归肺、脾、肾、膀胱经，具有行气止痛、温肾散寒、缩尿止遗的作用。现代研究证实，乌药具有抗炎镇痛、抗病毒、抑菌、抗氧化、抗疲劳、调节消化道、松弛内脏平滑肌、改善中枢神经系统功能、调理妇科联病等药理作用［4］。

“药对”（或称对药）是一种相对固定的组方单位，也是复方配伍中最基本的单位。药对是最简单的复方，虽无君、臣、佐、使的完整性，但其药简力捷，也能体现方剂配伍中的阴阳、君臣、补泻等关系［5］。益智仁和乌药的药对是来源于《妇人良方》缩泉丸的主要组成部分，乌药以行散为主，益智仁以温补收摄为要。二药伍用，在临床上对于肾阳虚DN多尿的患者有较好的疗效［6-7］。参照文献，本次实验成功获得糖尿病肾病的大鼠模型。由于迄今为止了解到的DN发病的机制非常复杂，目前认为DN的发病机制与糖代谢紊乱及由此所致的非酶糖化、多元醇通路激活、蛋白激酶C激活、脂代谢紊乱、高血压所致肾血流动力学改变、氧化应激、血管活性物质及细胞因子、遗传因素等多种因素有关［8-11］。超氧化物歧化酶（Supemxide dismutase，SOD）是衡量自由基基础代谢状态的主要指标，而血清中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平通常可反映细胞和组织内氧化损伤情况。由于近年来，大量研究报道SOD活性降低和MDA含量增高在多种器官肿瘤组织中和组织增生性疾病的发生发展机制有重要意义，并认为这种氧自由基的产生和清除平衡的失调与各种腺体合成和分泌激素有关。SOD和MDA在肾上腺皮质疾病患者血清和组织中表达异常，联合检测SOD、MDA可能为肾上腺皮质疾病进行鉴别诊断。本实验发现未用药的模型组受到SOD的损害，而用药的高剂量组有效干预了大鼠的肾避免氧化损害，故表明益智仁-乌药醚提取物高剂量对于延缓糖尿病肾病的进展有明显作用。

［1］陈慎仁，郭海婷.糖尿病肾病的诊断与评估［J］.中华临床医师杂志（电子版），2013，7（8）：13-17.

［2］陈萍，王培培，焦泽沼，等.益智仁的化学成分及药理活性研究进展［J］.现代药物与临床，2013，28（4）：617-623.

［3］谢毅强，刘嫱，韦祎，等.益智提取物抗糖尿病肾病有效部位的筛选［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（3）：114-117.

［4］刘卫东，温中京，郭伟娣，等.乌药提取物抗疲劳作用的实验研究［J］.浙江中医杂志，2006，41（7）：428-429.

［5］顾浩，王耘，肖斌.基于药性组合的药对配伍规律研究［J］.中国中医药信息杂志，2010，17（11）：82.

［6］马继兴.《神农本草经》辑注［M］.北京：人民卫生出版社，1995.

［7］李时珍，刘衡如，刘山永.本草纲目［M］.北京：华夏出版社，2002.

［8］Clark S L，Santin A E，Bryant P A，et al.The initial noncovalent binding of glucose to human hemoglobin in nonenzymatic glycation［J］.Glycobiology，2013，23（11）：1 250-1 259.

［9］Tripathi Y B，Yadav D.Diabetic nephropathy：causes and managements［J］.Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov，2013，7（1）：57-64.

［10］Singh R R，Lankadeva Y R，Denton K M，et al.Improvement in renal hemodynamics following combined angiotensin II infusion and AT1R blockade in aged female sheep following fetal unilateral nephrectomy［J］.Plos One，2013，8（7）：68 036.

［11］Al-Malki A L，Sayed A A，Rabey H E.Proanthocyanidin attenuation of oxidative stress and NF-κ B protects apolipoprotein E-Deficient mice against diabetic nephropathy［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013（11）：769 409.

（编辑：张世霞）

Experimental study of the ether extract of the Yizhiren-Wuyao on expression of Mn-SOD，MDA in rats with diabetic nephropathy

Liang Wei，Tan Nianhua，Pan Ziyi，Xie Yiqiang，Wei Yi
（Hainan Medical College，Haikou Hainan 571199）

Objective：To observe anti-oxidative stress of ether extract with different concentrations of fructus alpiniae oxyphyllae，radix linderae in rats with diabetic nephropathy（DN）.Methods：DN rat models were established by feeding with high glucose and high-fat diet combined with streptozotocin intraperitoneal injection for 4 weeks.Rats were randomly divided into blank group，Low，medium and high dose of ether extract of the Yizhiren-Wuyao groups，western medicine group and model group.After intragastric administration for 4 weeks，the content of Mn-SOD，MDA in serum were detected.Results：Compared with model group，Mn-SOD was increased，MDA was decreased in Yizhiren-Wuyao ether extracts groups and western medicine group（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion：The curative effect of ether extract of the Yizhiren-Wuyao on diabetic nephropathy may be related to it's influence on content of SOD，MDA.

diabetic nephropathy（DN）；ether extract of Yizhiren-Wuyao；Mn-SOD；MDA

R285

A

1671-0258（2016）03-0020-03

国家自然科学基金项目（81473618）；海南省自然科学基金项目（812186）；海南省中药现代化专项（ZY201332）；海口市重点科技项目（2013-50）；海南省高等学校优秀中青年骨干教师项目（2013）；海南医学院大学生创新项目（HYCX201307）

梁薇，医学学士，E-mail：362303450@qq.com

韦祎，副教授，医学硕士，E-mail：SUE0900CN@163.com