植物雌激素防治骨质疏松作用的机制进展

王冬生 韩婧 康文博 赵建宁*

1.第二军医大学南京临床医院南京军区南京总医院骨科，南京 210002 2.第四军医大学药理学教研室，西安 710032

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病，同时OP又是骨衰老导致的退行性疾病[1]。据统计，全球OP患者超过2亿，在世界常见病的发病率排行第7名，在中国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。OP可分为原发性和继发性两种，其中原发性骨质疏松占骨质疏松的90%，又可分为2种亚型，即I型和II型(I型又称绝经后骨质疏松，II型为老年性骨质疏松)。其中，I型骨质疏松又占原发性骨质疏松的绝大多数，I型骨质疏松发病主要由于绝经后妇女合成和分泌雌激素的能力下降、成骨细胞形成减少、成骨功能减退、破骨细胞形成和募集增加、破骨作用(骨吸收)增强。骨形成和骨吸收之间出现负平衡，使骨量减少，从而发生骨质疏松症[2]。

目前临床防治骨质疏松药物的主要理论基础包括：1.抑制破骨细胞过量的骨吸收，抑制绝经后骨质疏松症患者和其他的骨代谢障碍所导致的高骨转换率；2.刺激成骨细胞骨形成和矿化成熟，同时也抑制破骨细胞增殖分化，使新骨的形成超过吸收最终使得骨量增加。其作用的靶点主要针对成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收。

植物雌激素(phytoestrogens)，一类天然存在于多种植物中的非甾体类化合物，在结构和功能上与内源性雌激素相似，能与体内雌激素受体(estrogen receptor，ER)选择性结合，通过调节雌激素受体具有雌激素样作用[3]。植物雌激素可以调节骨代谢(骨重建)平衡、促进成骨细胞的骨形成、抑制破骨细胞的骨吸收、诱导和调控骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化方面有着重要作用。其主要用于绝经后妇女和老年性骨质疏松，但对子宫和乳腺等雌激素受体阳性的组织器官不会产生刺激增生等副作用，从而在骨质疏松的防治中引起广泛关注。本文从植物雌激素的植物来源、结构类型及防治骨质疏松中的作用机制等方面的研究进展进行综述，为临床治疗骨质疏松症提供新策略、新方法。

1 植物雌激素的植物来源及结构类型

植物雌激素是能与机体雌激素受体结合，调节机体代谢的一类次生代谢产物。广泛分布于豆科植物中[4]，也分布于苋科、鸢尾科、桑科及蔷薇科等。其结构类型主要为黄酮类(包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮等，其中以异黄酮类为主)，木脂素类，香豆素类及其它类型等。

1.1 植物来源

植物雌激素主要分布在豆科植物中，其主要的植物来源见表1。

表1 植物雌激素在豆科植物中的分布[5]Table 1 Distribution of phytoestrogens in the legume

此外，亚麻科亚麻(LinumusitatissimumL.)，小檗科淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim.)，五加科人参(PanaxginsengC.A.Mey.)，伞形科柴胡(BupleurumchinenseDC.)和蛇床(CnidiummonnieriL.Cuss.)，石蒜科仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)，石竹科王不留行(Vaccariasegetalis(Neck.) Garcker)，莎草科莎草(CyperusrotundusL.)，鸢尾科射干(Belamcandachinensis(L.) Redouté)，茜草科巴戟天(MorindaofficinalisHow)，大麻科啤酒花(HumuluslupulusLinn.)，薯蓣科山药(DioscoreaoppositaThunb.)，毛茛科黑升麻(CimicifugaracemosaL.Nutt.)，银杏科银杏(GinkgobilobaLinn.)等均含有植物雌激素类成分。

1.2 植物雌激素的结构类型

1.2.1异黄酮类(isoflavone)：异黄酮类植物雌激素[6]是以3-苯基苯并吡喃酮为母核的多羟基酚类化合物，主要的活性化合物包括：大豆黄酮(daidzein)，染料木黄酮(genistein)，黄豆黄素(glycitein)、刺芒柄花素(formononetin)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)、黄腐酚(xanthohumol)、异黄腐酚(isoxanthohunol)、补骨脂二氢黄酮(bavachin)、新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone)、异补骨脂查尔酮(isobavachalcone)、葛根素(puerarin)、淫羊藿苷(icariin)、山柰酚(kaempferol)、光甘草定(glabridin)和光甘草素(glabrene)等。

图1 异黄酮类植物雌激素的结构类型及主要活性化合物Fig.1 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of isoflavone phytoestrogens.

1.2.2木脂素类(lignan)：木脂素类植物雌激素为一类主要通过对羟基苯乙烯单体氧化耦合而成的化合物，包括：开环异落叶松树脂酚(secoisolariciresinol)、罗汉松脂素(matairesinol)、落叶松树脂醇(lariciresinol)、松脂酚(pinoresinol)、异落叶松脂素(isolariciresinol)、梣皮树脂醇(medioresinol)、丁香脂素(syringaresinol)、去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid)和脱水开环异落叶松脂酚(anhydrosecoisolariciresinol)等[7]。

图2 木脂素类植物雌激素的结构及主要活性化合物Fig.2 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of lignan phytoestrogens.

1.2.3香豆素类(coumarins) ：香豆素类植物雌激素是结构中具有苯并α-吡喃酮母核为基本骨架特征的顺式邻羟基桂皮酸内酯类化合物，其中雌激素样化合物有拟雌内酯香豆雌酚(coumestrol)、蛇床子素(osthole)、异欧前胡素(isoimperatorin)、补骨脂素(psoralen)、异补骨脂素(isopsorlen)及其糖苷补骨脂苷(psoralenoside)和异补骨脂苷(isopsoralenoside)等[8]。

图3 香豆素类植物雌激素的结构及主要活性化合物Fig.3 Chemical structures and mainly bioactivity compounds of coumarin phytoestrogens.

1.2.4其他结构类型的植物雌激素：除上述3种类型的植物雌激素外，二羟基苯酸内酯类的α-玉米赤霉素(α-zearalanol，α-ZAL)，茋类化合物白藜芦醇(resveratrol)，王不留行中的环肽segetalin A、B、G、H，蒽醌类化合物大黄素(emodin)、大黄酚(chrysophanol)、大黄酸(rhein)、大黄素甲醚(physcion)，广藿香烷型倍半萜香附子烯(cyperene)，甾醇类的β-谷甾醇(β-sitosterol)、蜕皮甾酮(ecdysterone)，三萜类的人参皂苷(ginsenoside)、三七皂苷(notoginsenoside)、柴胡皂苷(saikosaponin)、黄芪皂苷(astragalosaponin)等其他类型化合物。

2 植物雌激素在防治骨质疏松过程中的作用机制

雌激素对骨代谢的调节有直接作用和间接作用[9]，其间接作用主要体现为：提高1α羟化酶活性，增加1，25-(OH)2D3合成，促进骨形成；促进降钙素(CT)分泌，抑制骨吸收；调节骨对甲状旁腺激素(PTH)敏感性或减少低钙对PTH的刺激，从而抑制PTH分泌，抑制骨吸收。目前，在成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)中均发现了雌激素受体(ER)的存在。故雌激素可直接作用于OB、OC上的ER抑制骨吸收，调节骨代谢[10]。天然异黄酮类物质具有雌激素样作用，能够抑制骨吸收，促进骨形成，维持骨代谢的动态平衡[11, 12]，还可以通过调节骨髓间充质干细胞成骨分化及骨质疏松相关信号通路[13]：ER、丝裂原蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)[14, 15]、过氧化物酶增殖子受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)[16, 17]、Wnt[18, 19]和Sirt1[20]等信号通路，促进成骨细胞的分化、增殖，对抗骨质疏松，从而有望成为一种新型的治疗骨质疏松的药物。

2.1 具有雌激素样作用

植物雌激素是一类存在于植物中，能与机体雌激素受体(ER)结合，产生雌激素样作用的非甾体类化合物。研究发现，大豆异黄酮能够抑制绝经后骨质疏松，增加骨骼强度，降低骨折风险[21]。植物雌激素抗骨质疏松的机制可能是通过雌激素受体α(ERα)途径调节成骨细胞形成、分化和转录因子，如骨形态发生蛋白，核心结合因子等的表达，增加成骨细胞的增殖和骨形成作用；以及通过雌激素受体途径调控骨代谢的RNKLRNK-OPG系统，抑制破骨细胞的形成、分化和骨吸收作用，维持成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，减少骨质的丢失。植物雌激素的生物活性约为雌激素的1/500-1/1000，副作用较小，主要用于绝经后妇女和老年性骨质疏松，但对子宫和乳腺等雌激素受体阳性的其他组织器官不会产生刺激增生等副作用。而且可以与机体中的钙有机结合，促进1,25-二羟基维生素D3的合成，增加肠道对钙的吸收，有效弥补了补钙吸收率低的弊端，从而在骨质疏松的防治中引起广泛关注。

2.2 促进BMSC成骨分化

近年来干细胞在再生修复和治疗方面显示出较好的应用前景，Wallace和Takako基于基因敲除小鼠的前期研究揭示了老龄性骨质疏松与骨髓间充质干细胞功能不良的相关性，提示一些关键基因在骨髓间充质干细胞的成骨向分化中起重要作用，其缺失可导致骨质疏松疾病发生[22-25]。骨髓间充质干细胞(BMSC)是成骨细胞的前体细胞，在骨形成及骨质疏松的过程中起着不可替代的作用[26]。临床研究证明，通过移植BMSCs能够在一定时间内使成骨不全患者的骨骼生长速度加快、骨密度增高、骨折发生率下降[22]。已有研究表明，植物雌激素在BMSCs骨代谢和生物学特性维持方面有特殊的贡献，通过抑制PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)和C/EBPα(CCAAT增强子结合蛋白α)尤其是TFs Runx2(成脂转录因子Runx2)和Sp7，调节ER通路及Wnt/β-catenin和Sirt1通路促进BMSCs成骨分化[27]。

2.3 参与调节与骨质疏松相关的信号通路

研究表明，植物雌激素防治骨质疏松作用的分子机制主要涉及ER、MAPK、PPARγ、Wnt和Sirt1等信号通路：植物雌激素通过结合并激活ERα和ERβ发挥骨保护作用；激活细胞膜ER引起细胞内MAPK的激活；可以抑制以PPARs介导的作用，抑制脂肪生成、促进骨生成；Wnt信号通路可促进成骨细胞的分化、增殖、存活，是成骨细胞的正调节蛋白；Sirt1与骨代谢、骨量关系密切，组蛋白的去乙酰化修饰可抑制骨形成，降低成骨细胞中骨钙素和碱性磷酸酶的表达，减少成骨细胞的增殖、分化。植物雌激素通过调节骨质疏松相关信号通路，促进骨形成，抑制骨吸收，达到防治骨质疏松的效果。

2.3.1ER通路：雌激素(Estrogen)是一类女性荷尔蒙，属于性类固醇激素。雌激素受体分为两大类：细胞核内的ERα和ERβ，核受体的膜性成分及属于G蛋白耦联受体家族的GPR30，Gaq-ER，ER-X[28]。雌激素通过促进成骨细胞增殖和破骨细胞凋亡，发挥抗骨质疏松的作用[29]。植物雌激素可直接参与机体的内分泌调节，一定剂量的植物雌激素在体内能够与ER结合，发挥雌激素样作用。当植物雌激素使用足够的剂量时，可以产生与体内17β-雌二醇相似的效能[30, 31]。食物中的植物雌激素在防治更年期综合征、绝经后骨质疏松症等方面有类似雌激素替代疗法(ERT)的积极作用[32]。不同种类的植物雌激素与雌激素受体结合的亲合力不同而显示出不同的作用效能。研究表明，异黄酮类化合物能使ERβ的AF-2表面更易于结合共调节因子，从而对靶基因具有ERβ依赖性的转录调节作用[33]。

雌激素缺乏时，骨代谢转换亢进，骨吸收超过骨形成，使血清中白细胞介素1，6(IL-1, IL-6)和肿瘤坏死因子β(TNF-β)增加。IL-1，IL-6均可刺激破骨细胞前体细胞的生成和分化，并使破骨细胞活性增加而促进骨吸收，TNF-β是骨吸收诱导剂。植物雌激素通过ER发挥生物效应，抑制这些细胞因子的产生，防止骨量减少[34]。染料木素[35]、黄豆黄素、白藜芦醇、人参皂苷、槲皮素和香豆雌酚等植物雌激素，通过调节ERα或ERβ与其他信号通路间的相互联系调节BMSCs的成骨、成脂分化[27]，维持BMSCs的骨代谢平衡，抑制骨质疏松发展。

2.3.2MAPK和ERK信号通路：丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)是真核生物细胞内广泛存在的一类介导细胞反应的重要信号传导系统[36]。该通路包括三种核心激酶(MAP3K、MAPKK和MAPK)，以及可能存在的上游(MAP4K)和下游组件(MAPKAPK)。MAPK信号通路主要包括ERK1/2通路、JNK通路、P38通路和ERK5通路。研究表明，胶原蛋白水解物可以刺激ERK1/2磷酸化，促进成骨细胞(osteoblast，OB)分化和增殖，腰椎骨密度(bone mineral density，BMD)增加，由此可见ERK1/2与骨质疏松的治疗有关[37]。JNK-Fra-1通路在水溶珍珠素(water soluble nacre factor，WSNF)诱导的OB矿化过程中发挥重要作用[38]，表明JNK通路与骨形成有关。骨形态发生蛋白(BMP)通过激活p38 MAPK-Smad信号通路增强C2C12细胞成骨分化和矿化。P38通过增加OB生成和减少破骨细胞(osteoclast，OC)分化改善骨质疏松[39]。由此可见，MAPK通路在骨质疏松发病机制中发挥重要调节作用。

染料木素呈时间、剂量依赖性调节磷酸化P38 MAPK信号通路来刺激鼠初级MSCs骨发生，但其产生的成骨分化却不需要ERK1/2信号调节。通过抑制ERK1/2磷酸化，使成脂标志物表达减少(PPARγ，C/EBP，FABP4的蛋白水平和脂质囊泡的积蓄)以及减少脂肪形成，特异性的激活下游的信号通路提高成骨分化[40]。MG-63细胞中加入25μg/ml和50μg/ml Kobophenol A，发现磷酸化P38显著增加，cyclin B1和CDK1蛋白表达增加，G2M期细胞比例显著增加[41]。以上研究表明，植物雌激素可以通过激活MAPK通路促进骨形成，对抗骨质疏松的发展。

2.3.3PPARγ信号通路：转录因子PPARγ作为类固醇激素膜受体PPAR的亚家族，能够调整MSC分化形成脂肪细胞。PPARγ信号通路能够被PPARγ受体激动剂与拮抗剂间接调节，也能通过上游抑制物来减少PPARγ和C/EBP mRNA的表达[42]。在没有成骨性因子时，PPARγ抑制不是骨发生刺激物所必须。剑麻皂素能够通过抑制PPAR γ和p38 MAPK信号通路促进骨髓间质细胞成骨分化[27, 43]。牛至属提取物黄酮类化合物为PPAR调节剂，可以抑制PPARγ蛋白进而影响脂肪形成[44]。桔梗皂苷通过调控上游的脂肪细胞分化靶点(Krueppel-like factor 2 (KLF2))抑制PPARγ的表达[45]。此外，白藜芦醇产生的sirtuin(sirt)信号通路显示刺激内皮细胞KLF2的表达，在MSCs下调PPARγ表达会产生聚集植物雌激素的作用，sirt信号通路和调节甲羟戊酸通路[46]。由此可见，植物雌激素通过PPAPγ信号通路可以调节MSCs脂肪形成，对抗骨质疏松。

2.3.4Wnt/β-catenin通路：Wnt信号通路在无脊椎动物和脊椎动物发育过程中起关键作用，参与了细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育中细胞定位控制等过程。研究证实，Wnt信号通路可促进成骨细胞的分化、增殖、存活，是成骨细胞的正调节蛋白[47]。激活Wnt通路可抑制破骨细胞活性，下调RANKL，增加骨保护素的表达[48]。Wnt 通路的主要内源性调节因子是硬化蛋白，由骨细胞分泌，通过与Wnt 配体上LRP-5 和LRP-6 受体结合特异性抑制Wnt 通路的活化，最终抑制骨量形成[49]。目前，硬化蛋白抗体被用于治疗骨质疏松临床研究。DKK-1 作为Wnt信号通路的抑制因子可抑制骨形成[50]。许多骨量丢失疾病患者的血清DKK-1含量升高，因此，通过抑制DKK-1的活性来治疗骨量丢失疾病成为近年来的研究热点[51]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子，可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化[52]。分泌型卷曲相关蛋白1(secreted Frizzled-related protein-1，sFrp-1)家族是一组与Wnt 受体Frizzled相关的蛋白，在各种组织中广泛表达，可直接与Wnt配基结合以抑制Wnt/β-catenin信号通路[53]。其中sFrp-1与骨质疏松间的关系最为密切[54]。sFrp-1基因敲除小鼠的成骨细胞活性增强，多处骨组织表现出松质骨骨密度、骨量和矿化率的上升[55]。

已有研究表明，印度黄檀中的异黄酮类植物雌激素可以通过激活BMP2和Wnt/β-catenin信号通路，促进MSCs成骨分化。生姜中的二芳基庚烷类植物雌激素可以激活GSK-3β的磷酸化，激活Wnt/β-catenin信号通路，防止骨流失。Wnt信号通路在骨形成中的重要作用，而植物雌激素对其通路中的众多蛋白的调控也成为治疗骨质疏松的潜在靶点，为治疗骨质疏松带来新希望。

2.3.5Sirt1信号通路：Sirt1 是哺乳动物沉默信息调节因子2(silent information regulator 2，Sir2)同源蛋白(Sirt1-7)中与酵母菌Sir2同源性最高的，也是第1个被发现的Sirtuin蛋白家族成员[56]。近年来研究发现，Sirt1 在骨质疏松症的发病、防治中同样发挥重要作用[57]。Sirt1 在成骨细胞的大量表达与提高老龄鼠骨密度有重要意义。Sirt1与骨代谢、骨量关系密切，组蛋白的去乙酰化修饰可抑制骨形成，降低成骨细胞中骨钙素和碱性磷酸酶的表达，减少成骨细胞的增殖、分化[20]。Sirt1敲除小鼠(Sirt1胚系突变的129/Sv小鼠)与野生型(Sirt1+/+)小鼠相比，Sirt1单倍体(Sirt1+/-)小鼠骨量、骨小梁数目、股骨体积分数、第4腰椎骨矿物质含量显著减少，雌性小鼠表现尤为突出；骨形成明显减少，矿化沉积率和骨形成率降低[58]。在去卵巢小鼠的骨髓中，还发现Sirt1 蛋白水平的降低伴随着骨髓脂肪细胞的增加[59]。

已有研究表明，Sirt1的激活剂白藜芦醇促进成骨细胞的分化，减少骨髓脂肪细胞的形成和破骨细胞的数量[60]。白藜芦醇在骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨分化中能促进Sirt1 与PPAR-γ结合，抑制PPAR-γ的活性，阻碍MSCs向脂肪细胞分化，促进骨形成[61]。PPAR-γ还可抑制Runx2 mRNA 的转录活性及成骨信号通路，包括Wnt 和转化生长因子β/BMP等[62]。Runx2是启动成骨转录程序的早期主要的转录因子，可诱导成骨细胞特异性基因的表达，如骨桥蛋白、骨钙素和碱性磷酸酶等。为与白藜芦醇具有相似作用的植物雌激素，通过Sirt1/Runx2信号通路调节MSCs成骨成脂分化平衡，临床治疗骨质疏松提供可能。

植物雌激素作为一种选择性的雌激素受体调节剂，与雌激素相比，其副作用相对较小，已在抗癌，防治心血管疾病，防治更年期综合症，抗骨质疏松、改善认知，防治代谢综合征等多方面，显示出了良好的应用前景。然而，植物雌激素的生物活性受多种因素的影响，如体内代谢途径，剂量，内源性雌激素水平，与其他药物及食物成分的相互作用等。而且，关于植物雌激素防治骨质疏松方面的研究，仍有许多问题需要探讨，如生物活性研究缺乏统一的评价标准，不良反应研究较少，作用机制研究不够系统，根据其结构特征判断化合物的雌激素样作用也不够全面。因而，还需要从细胞、整体动物和临床试验等各个方面，探讨植物雌激素在防治骨质疏松中在作用，为植物雌激素的临床应用提供科学依据。