PI3K-Akt-mTOR通路及其小分子抑制剂的研究进展

何俏军，董晓武，朱虹，胡永洲，杨波

(浙江大学药理毒理研究所，药物发现与设计研究所，浙江省抗肿瘤药物临床前研究重点实验室，浙江大学药学院，浙江 杭州 310058)

PI3K-Akt-mTOR通路及其小分子抑制剂的研究进展

何俏军Δ，董晓武，朱虹，胡永洲，杨波

(浙江大学药理毒理研究所，药物发现与设计研究所，浙江省抗肿瘤药物临床前研究重点实验室，浙江大学药学院，浙江 杭州 310058)

磷脂肌醇(PI3K)-蛋白激酶B(PKB，Akt)-雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)通路在细胞的存活、增殖和分化等过程中发挥关键作用。PI3K-Akt-mTOR信号通路的异常激活和人类肿瘤的发生密切相关，许多靶向该通路的小分子抑制剂已经进入临床试验中。本文将对近年来PI3K-Akt-mTOR信号通路与肿瘤的关系及PI3K-Akt-mTOR抑制剂抗肿瘤作用研究进展，并结合本课题组的相关研究成果进行综述。

PI3K-Akt-mTOR通路；小分子抑制剂；恶性肿瘤

磷脂肌醇(PI3K)-蛋白激酶B(PKB，Akt)-雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)通路广泛存在于细胞中，在维持蛋白合成、存活、生长、转移、凋亡等方面发挥重要作用。研究发现，该通路的相关基因突变或过表达与肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌和子宫内膜癌等。已成为肿瘤治疗研究的重要靶点之一，目前，已有数十个靶向该通路的候选药物进入临床研究。此外，也有研究发现PI3K和PTEN在肿瘤细胞上皮间质转化、DNA修复、自噬和衰老中发挥作用[1]。本文就PI3K-Akt-mTOR信号通路及其关键蛋白与肿瘤的关系，临床PI3K-Akt-mTOR抑制剂的研究进展，以及本课题组在靶向PI3K-Akt-mTOR通路抑制剂研究领域的相关结果进行综述。

1 PI3K-Akt-mTOR通路与肿瘤

PI3K-Akt-mTOR的致癌潜力主要体现以下2个方面：①该通路的异常激活可以诱导细胞恶性转化和形成肿瘤[2-4]；②该通路的激活通常伴随着下游通路关键分子的改变，如PIK3CA，Akt1，PTEN的基因突变；PIK3CA，Akt1，Akt2的基因扩增；肿瘤抑制基因PTEN的缺失等[5](见表1)。该通路的上游通路主要包括各类受体酪氨酸激酶，如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2，HER2)，肝细胞生长因子受体(MET)和成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)等，这类受体的突变、扩增往往导致PI3K-Akt-mTOR信号轴的失调，最终引起肿瘤恶性进展；而另一类以抑癌基因为主的上游分子则扮演着负性调控PI3K-Akt-mTOR通路的作用，如VHL(Von Hippel-Lindau disease tumour suppressor)，结节性硬化症基因(Tuberous sclerosis genes TSC1和TSC2)，苏氨酸-丝氨酸蛋白激酶LKB1，神经纤维瘤蛋白(Neurofibromin，NF1)等。

表1 PI3K信号通路异常和相关肿瘤类型Tab.1 Relationship between abnormal PI3K signaling pathway and tumor types

1.1 PI3K PI3K是PI3K-Akt-mTOR信号通路上的关键蛋白[6-7]，可通过磷酸化包括磷脂酰-4,5-二磷酸脂(phosphatidylinositol-3,4,5-bisphosphate，PIP2)在内的磷脂酰肌醇环上3位的羟基产生磷脂酰肌磷酸脂，如磷脂酰-3,4,5-三磷酸脂(phosphatidylinositol-3,4,5-bisphosphate，PIP3)，作为重要的第二信使作用下游的效应子来调节细胞内的多种生命活动[8-9]，包括细胞存活、生长、增殖和代谢。根据活化机制、结构特征以及对脂类底物选择型的不同，PI3K分为I、II和III型，其中I型又分为IA和IB型，且IA型与肿瘤生物学行为相关度最高[1]，包括头颈部癌症、肺癌、甲状腺癌、子宫癌等[10-12]。PI3K的IA型包含PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ 3个亚型，IB类PI3K仅PI3Kγ一个亚型。在肿瘤发生和发展的过程中，PI3Kα的激活和PTEN的功能缺失往往同时存在。与PI3Kα在整个肿瘤发生发展过程中的持续激活相比，PTEN的功能缺失往往存在于肿瘤恶性发展的后期甚至是肿瘤转移之后的阶段[13-14]。PI3Kβ和具有致癌性的Ras基因以及酪氨酸激酶在介导PTEN缺失的肿瘤形成过程中起关键作用[15]，PI3Kδ可能作为一些特定类型的肿瘤治疗靶点[16]。

1.2 Akt Akt也被称为蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一种分子量约为60kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶，由分别受基因PKBα，PKBβ，和PKBγ编码的Akt1，Akt2及Akt3三种亚型组成[3]。虽然这3种亚型定位的染色体不同(Akt l/2/3分别为14q32.32、19q13.1-19q13.2和lq44)，但亚型之间有着很高的序列同源性(大于80%)。3个亚型具有相似的结构组成：氨基末端的PH结构域(pleckstrin homologous domain，PH)、中部的激酶结构域(kinase domain，KD)和羧基末端的调节结构域(regulatory domain)。Akt作为PI3K-Akt-mTOR信号通路中的关键节点蛋白一直备受关注。首先，Akt可抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞生存[17-19]。主要表现在：①能够直接磷酸化促凋亡蛋白Bad上Ser136位点，从而阻断了Bad传导的凋亡信号；②激活转录因子NF-κB，通过对NF-κB和P53的间接作用影响细胞存活，并且Akt能通过磷酸化P53结合蛋白MDM2，而影响P53的活性，通过增加P53蛋白的降解而促进细胞存活；③抑制Forkhead家族转录因子的活性，下调Fas/FasL诱导的凋亡；④抑制线粒体释放凋亡因子及细胞色素C，并磷酸化Caspase-9的Ser 196位点使其失活，阻断其促凋亡通路。其次，Akt可促进肿瘤细胞周期运行，导致肿瘤细胞过度增殖[19-21]。主要表现在：①抑制GSK3β的激酶活性，从而阻止细胞周期Cyclin D1的降解，由于Cyclin D1的水平对细胞周期G1/S的转换至关重要，而GSK3β通过磷酸化作用可促进泛素介导的Cyclin D1的降解；②干预p21Cip1的磷酸化和与PCNA结合而下调p21Cip1的活性，导致细胞增殖；③直接磷酸化p27Kip1的Thr157位点，导致p27Kip1在细胞质中滞留；④抑制mRNA的转录后阻遏物4E-BP-1，促进mRNA的转录。此外，Akt还可促进肿瘤细胞的血液供应和转移。Akt直接磷酸化并激活内皮型NO合酶(eNOS)，从而刺激血管舒张、新血管形成以及血管内皮生长因子(VEGF)介导的细胞迁移；另外，可通过mTOR1上调缺氧诱导因子HIF-1α的表达，促使血管内皮生长因子和其他血管生成因子的表达和分泌，通过自分泌和旁分泌的信号通路促进血管生成[22]。

1.3 mTOR 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase，PIKK)超家族成员。mTOR同样是PI3K-Akt-mTOR信号通路的关键位点，其调节异常可见于多种恶性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等[23-24]。该蛋白在细胞内以2种不同的复合物形式存在，即mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)[25]。其中，mTORC1位于Akt激酶的下游，直接通过磷酸化S6K1和4E-BP1调控基因转录、mRNA剪接以及蛋白质合成；mTORC2则位于Akt激酶的上游，通过磷酸化Akt及AGC家族激酶调控细胞的生长、存活和迁移[26-27]。

2 PI3K-Akt-mTOR抑制剂

在过去的十多年时间里，靶向PI3K-Akt-mTOR的抑制剂的研究取得了重要进展，有大量不同结构类型、作用机制的活性化合物被发现，并有数十个候选药物进入了临床研究，根据其作用靶点和选择性可大体上可以分为5类(见表2)：①泛PI3K抑制剂；②PI3K/mTOR抑制剂；③PI3K亚型选择性抑制剂；④Akt抑制剂；⑤mTOR选择性抑制剂。其中，泛PI3K和Akt抑制剂的临床研究占比最高，均达到了27%，PI3K-mTOR双重抑制剂的临床研究数紧随其后，达到了19%(见图1)。此外，唯一上市用于肿瘤治疗的mTOR抑制剂(替西莫司和依维莫司等雷帕霉素衍生物)是结合于mTOR的FRB区域(FKBP12-rapamycin binding domain)，进而通过诱导该蛋白的变构发挥抑制作用[28]，仅能抑制mTORC1活性而无法抑制mTORC2[29-30]，因而，雷帕霉素衍生物在单独用药时只在一些恶性肿瘤上起作用，如肾细胞癌(依维莫司和西罗莫西)，神经内分泌肿瘤(依维莫司)[31]和套细胞淋巴瘤(西罗莫西)[29]。

表2 PI3K和Akt抑制剂的临床进展Tab.2 Clinical progress of PI3K and Akt inhibitors

续表

图1 靶向PI3K-Akt-mTOR抑制剂以及相应的临床研究Fig.1 Inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR and its related clinical application

2.1 PI3K抑制剂 自1980年PI3K被发现以来，其生物学功能和作为抗肿瘤治疗靶点的前景逐渐为研究人员所认识。从最早出现的泛PI3K抑制剂(Wortmannin和LY294002)，到后来出现的第2代亚型选择性PI3K抑制剂。截止目前，已经有多个不同结构类型、不同作用机制的PI3K抑制剂进入了各种临床研究，包括泛PI3K抑制剂(BAY80-6946、GDC0941等)、PI3K特异性的抑制剂(BKM-120、CAL101等)、PI3K/mTOR双重抑制剂(BEZ-235、GSK-2126458、PF-04691502等)，充分证实了PI3K作为恶性肿瘤治疗靶点的应用前景。

本课题组以泛PI3K抑制剂XL-765和XL-147的喹喔啉结构为基本骨架，基于其与PI3K活性口袋的作用模式，开展了一系列的合理药物设计、合成和抗肿瘤活性评价工作，简述如下：

① N-芳基喹喔啉胺类衍生物：通过在喹喔啉环的2位引入不同的芳胺片段以及并在3位引入不同的芳磺酰基片段，获得了一系列结构全新的N-芳基喹喔啉胺类衍生物1(见图2)[32]。活性测试结果表明，大部分化合物表现出强效的细胞增殖抑制活性(PC3，A549，HCT116，HL60和KB细胞)，其中2-芳胺基芳环上引入甲氧基、氨基、羟基等取代基对其抗肿瘤活性有利。N-苯基喹喔啉胺类化合物1a活性最优，其PI3Kα抑制活性(IC50)为0.07μM，对受试细胞株(PC3，A549，HCT116和HL 60)增殖抑制的IC50分别达到了0.14 μM、0.07 μM、0.95 μM和0.05 μM，其活性明显优于阳性对照LY294002。

图2 N-芳基喹喔啉胺类PI3K抑制剂的发现Fig.2 Substituted amine derivatives of N-aryquinoxaline as PI3K inhibitors

② N-脂肪环喹喔啉胺类衍生物：以文献报道的结构多样的PI3K抑制剂为基础，采用Catalyst软件包构建PI3Kα的药效团模型Hypo1，并对数据库进行虚拟筛选。经活性测试和构效关系分析，最终发现了活性中等，但结构新颖的N-吗啉喹喔啉胺类化合物2[33]，其对PI3Kα的抑制活性(IC50)达到了0.44μM。在此基础上，课题组结合生物电子等排和类似物设计等方法，进一步设计、合成了一系列N-脂肪环喹喔啉胺类衍生物[34-35]。PI3Kα抑制实验表明，N-羟基哌啶喹喔啉胺类化合物3活性最优，如化合物3a对PI3Kα的抑制活性(IC50)达到了0.025μM，此外，该化合物能明显抑制磷酸化Akt蛋白的表达，进一步证实其抗肿瘤活性是通过作用于PI3K信号通路而起效的。(见图3)。

图3 N-脂肪环喹喔啉胺类PI3K抑制剂的发现Fig.3 The discovery of substituted amine derivatives of N-aliphatic ring-quinoxaline as PI3K inhibitors

2.2 PI3K/mTOR双重抑制剂 基于PI3K和mTOR的催化结构域的结构相似性，联合使用PI3K/mTOR抑制剂使得同时靶向2条通路成为可能(mTORC1、mTORC2以及PI3K)。ATP竞争性的PI3K/mTOR小分子抑制剂(尤其是PI3Kα/mTOR双重抑制剂)不仅能同时抑制mTORC1和mTORC2，还能防止激活S6K-PI3K等负反馈通路，从而避免再次活化PI3K-Akt-mTOR信号通路，发挥其抗肿瘤作用。目前已有多个PI3K/mTOR双重抑制剂处于不同的临床研究阶段，如GSK2126458、XL-765、BEZ235、NVP-BGT226、GDC-0980和PKI-587等。

本课题组以PI3K/mTOR双重抑制剂GSK2126458为先导化合物，分析其与PI3Kγ共晶结构和分子对接结果(GSK2126458与PI3Kα的结合模式)，发现无论PI3Kγ(Lys802、Ala885、Lys890)还是PI3Kα(Arg770、Ser854、Gln859)的溶剂区均以亲水性氨基酸残基为主，因此，在GSK2126458的喹啉环的4位引入合适的取代基与PI3Kα溶剂区中的Arg770、Ser854或Gln859发生氢键作用，可进一步增强其与PI3K的相互作用，同时还能改善其物理化学性质(见图4)[36]。研究还发现，喹啉环4位以炔基为连接链的衍生物4的活性最优，部分化合物显示了与GSK2126458相当的PI3K抑制活性，对人前列腺癌细胞株PC3、结肠癌细胞株HCT116均表现出中等到强的增殖抑制活性。其中，化合物4a活性最优，PI3Kα抑制活性(IC50)为1.63 nM，对受试细胞株(PC3、HCT116)增殖抑制的IC50分别达到了0.37、2.47 μM，其活性优于阳性对照BEZ-235。激酶选择性实验证实，化合物4a为泛PI3K/mTOR双重抑制剂，其对PI3Kβ、PI3Kδ、PI3Kγ及mTOR的抑制作用(IC50)分别为6.91、0.38、2.14、3.26 nM。Western blot实验证明化合物4a确实可明显抑制底物蛋白pAkt(Ser473)的磷酸化。

图4 4-炔基喹啉类PI3K/mTOR双重抑制剂Fig.4 The discovery of 4-alkyne-quinoxaline derivatives as PI3K/mTOR dual inhibitors

2.3 Akt抑制剂 Akt处于PI3K-Akt-mTOR通路的核心位置，与肿瘤细胞凋亡和细胞周期相关蛋白和基因的调控密切相关。随着Akt结构、功能和作用机制的不断阐明，小分子Akt抑制剂在抗肿瘤领域的应用受到越来越广泛的关注，目前已有大量不同结构类型的小分子Akt抑制剂被报道[37-38]。根据这些抑制剂与Akt的作用方式主要可分为三大类：①磷脂酰肌醇(PIP)类似物抑制剂；②变构抑制剂；③ATP竞争性抑制剂。自2000年以来，先后有10多个Akt抑制剂进入临床研究阶段，其中研究最深入的当属磷脂酰肌醇(PIP)类似物抑制剂Perifosine，它在早期的临床阶段对多种肿瘤显示出较好的治疗作用，尽管在治疗多发性骨髓瘤和顽固性结直肠癌III期临床试验中最后以失败告终，然而其作为首例Akt候选药物对该领域的新药研发有着关键的指导意义。第2个基于ATP竞争机制的GSK690693是唯一通过静注给药进入临床研究的小分子Akt抑制剂，由于在I期临床试验中表现出高血糖副作用而中止；处于II期临床试验阶段的还有2个高活性的Akt抑制剂Uprosertib(GSK2141795)和Afuresertib(GKS2110183)[39-40]，主要以联合用药方式开展药效评估。Akt变构抑制剂MK2206[41-42]临床进展迅速，目前已启动了多项II期临床试验，用于多种实体瘤的治疗。Akt变构抑制剂ARQ092用作实体瘤治疗药物已进入Ib阶段。GDC-0068是唯一实现PKA选择性的ATP竞争性抑制剂[43]，I期临床试验结果显示其与一般化疗药联合使用对多种实体瘤有明显治疗作用，且毒性可控，现也已进入II期临床阶段。AZD5363也是一个很有潜力的ATP竞争性Akt抑制剂[44]，与PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)联用取得了可喜的临床I期数据，目前关于AZD5363组合物的II期临床试验正在开展。

本课题组在寻找结构新颖的Akt抑制剂方面目前已取得了一些进展，获得了多个具有进一步发展前景的候选药物分子，表述如下：

① 黄酮类衍生物：针对文献报道的24个结构多样的ATP竞争性Akt1抑制剂进行定量构效关系，采用Catalyst软件包构建了Akt1的药效团模型，并进行虚拟筛选，同时结合SYBYL/FlexiDock程序的评价结果，优选了9个化合物进行Akt1活性测试，发现了Akt1抑制活性中等(IC50：5.4μM)但结构新颖的Akt抑制剂异戊烯基黄酮类化合物5[45]，Western blot证明该化合物能明显抑制底物蛋白pGSK3β的磷酸化。此外，药效团模型和分子对接模型均指出，该化合物的异戊烯基片段与Akt1活性口袋的甘氨酸富集区Phe161存在疏水作用，为活性所必须。为验证这一点，采用末端含疏水基团的Mannich碱替代异戊烯基以简化该类化合物的合成方法(以天然黄酮类化合物经一步Mannich化即可获得目标化合物)[46]，结果表明，N-甲基苄胺取代的槲皮素Mannich化产物6c的活性与异戊烯基黄酮类化合物5相当，其Akt1抑制活性(IC50)为5.28 μM，对HL-60、OVCAR-8、PC-3、HepG2肿瘤细胞的增殖抑制活性(IC50)分别达到了7.56、16.69、15.45、7.20 μM(见图5)。与此同时，基于所构建的药效团模型，发现了异补骨脂黄酮(IBC，一类异戊烯基查耳酮类衍生物)[47]可通过ATP竞争性的方式可逆的抑制Akt的催化磷酸化活性，表明IBC可直接作用于Akt激酶并抑制其活性，IC50值为32.90 μM。研究还发现，IBC作用后，OVCAR-8和PC3细胞中Akt在Ser-473位点的磷酸化迅速下降，而且IBC还可抑制OVCAR-8和PC3细胞中Akt下游GSK3β及其他底物的磷酸化。Akt的活化须先后经历2个位点的磷酸化，分别是Thr-308和Ser-473位点。IBC引起的Akt活化的减少主要是由于Ser-473位点磷酸化的下降引起的，而Thr-308位点的磷酸化水平基本不受IBC调控，表明IBC并不影响PI3K和PDK1依赖的Thr-308位点的磷酸化。

图5 黄酮类Akt抑制剂的发现Fig.5 The discovery of flavonoid derivatives as Akt inhibitors

② 二苯甲胺类衍生物：以临床I期候选药物AT13148为先导化合物，在药效团模型和分子对接模型的指导下，通过在二苯甲胺的氨基上引入不同的侧链基团，考察二级胺取代类型的衍生物对Akt抑制活性和激酶选择性等的影响，同时采用生物电子等排原理，用3-取代吡啶、4-取代对位吡啶、4-取代吡唑等基团来代替先导物结构中的嘌呤环，获得了一系列二苯甲胺类衍生物7(见图6)[48]。体外抗肿瘤活性研究表明，所合成的化合物对3种肿瘤细胞株(OVCAR-8、HL60、HCT116)均显示了中等到强的抑制活性，其中位阻性基团叔丁基取代在二苯甲胺上时Akt1活性最优(IC50=38 nM)，化合物7d对所有细胞株(OVCAR-8、HL60和HCT116)均具有明显的抑制作用，IC50值在5.3～8.9 μM之间。同时，化合物7d表现出良好的激酶选择性，对PKC的选择性达到了85倍，而对Aurora A、Drak、IKKb、GSK3b、SYK和JAK2等激酶不存在明显抑制。表明在二苯甲胺的氨基上引入大位阻基团仍可以保持其强效的Akt抑制活性，同时能提高其对PKC等激酶的选择性，该结果为选择性Akt抑制剂的研究提供了一种新的策略。

图6 二苯甲胺类衍Akt抑制剂的发现Fig.6 The discovery of diphenylamine derivatives as Akt inhibitors

③ 4-氨基嘧啶类衍生物：为提高Akt激酶分子对接模型的预测准确度和可靠性，采用Discovery Studio软件，获得打分函数的评价指标，整合配体分子与关键氨基酸残基(Glu228，Ala230，Glu234，Glu292和Phe163)的相互作用力和分子描述符(ClogP、tPSA)等参数，并采用人工智能技术(支持向量机，SVM)建立了非线性的定量构效关系(MD-QSAR)模型，极大地提高了分子对接模型的预测能力，其对训练集、测试集以及交叉验证数据集的预测准确度(R2)分别达到了0.948、0.907、0.794[49]。随后将该模型用于指导4-氨基嘧啶类衍生物的设计，并合成了2个系列目标化合物8和9用于对模型的反验证工作(见图7)。活性测试结果表明，所获得的化合物表现出中等到强的Akt抑制活性和肿瘤细胞增殖抑制活性，其中化合物9c活性最优(IC50=7.7 nM)，对肿瘤细胞株(OVCAR-8，HCT116)均有明显的抑制作用，IC50值分别为22.67、5.15 μM。结果表明整合了分子对接和人工智能技术的新型QSAR模型将有助于开展针对某一个特定结构类型抑制剂的理性药物设计工作。

图7 4-氨基嘧啶类Akt抑制剂Fig.7 The discovery of 4-aminopyrimidine derivatives as Akt inhibitors

④ 吡唑-呋喃甲酰胺类衍生物：构象限制策略是一种经典的药物设计方法，可降低分子的柔性、改善分子与靶标的结合力同时也改善药代动力学行为，并产生新的结构骨架[50-51]。本课题组以GSK2141795和AT-7867作为先导，采用构象限制、骈合原理等理性药物设计方法，考察不同的连接链对活性的影响，成功设计、合成了一系列构象相对稳定的吡唑-呋喃甲酰胺类衍生物[52](见图8)。大部分目标分子呈现出中等到强的Akt1抑制活性，化合物10 d是该类结构骨架中与先导分子GSK2141795最相近的分子，其亦被证实为该系列活性最优化合物，IC50=61 nM，对肿瘤细胞(HCT116、OVCAR-8)均具有明显的抑制作用，IC50值分别为9.76、7.76 μM。在激酶选择性方面，化合物10d对AGC家族的激酶均表现出强效的抑制作用，包括对Akt2、Akt3、ROCK1、MSK1、PRKG1、PSK1、P70S6K和PKA，在0.5 μM浓度下，抑制率均超过了80%。而对非AGC家族的激酶该化合物又表现出非常高的选择性，即使在10 μM浓度下，对ABL、JAK2、BRAF、CHK1、PI3K、mTOR、CDK2、GSK3β、AuroraA等激酶不存在明显抑制。此外，Western blot实验证明化合物10d能明显抑制Akt底物蛋白pGSK3β的磷酸化(PC-3细胞)，进一步ELISA实验结果显示化合物10d对于LNCaP细胞中Akt底物蛋白PRAS40的磷酸化抑制活性高达30.4 nM。

图8 吡唑-呋喃甲酰胺类Akt抑制剂的发现Fig.8 The discovery of pyrazole-furoylamide derivatives as Akt inhibitors

2.4 mTOR抑制剂 雷帕霉素类mTOR变构抑制剂已在临床用于抗肿瘤治疗，但它只能选择性抑制mTORC1，对mTORC2无抑制作用，因而其在临床上适用的肿瘤谱很窄。有研究表明可通过发展ATP-竞争性mTOR的抑制剂(同时抑制mTORC1和mTORC2)来增强其抗肿瘤作用，因为这类抑制剂可显著抑制mTORC1，通过下调4E-BP1的磷酸化水平进而有效地干预肿瘤细胞蛋白质的生物合成[53-54]，同时，抑制mTORC2，降低Akt的磷酸化水平，可有效避免S6K/IRS1/PI3K负反馈通路释放导致的Akt磷酸化水平升高。因而，ATP-竞争性mTOR的抑制剂不仅有望提高治疗效果，还能拓宽mTORC1抑制剂的抗瘤谱，使患者在更大程度上获益。目前，处于临床研究的小分子mTOR激酶抑制剂主要包括PI3K/mTOR双重抑制剂和mTOR选择性抑制剂，前者已在前文表述，后者的代表性化合物主要有AZD-2014、MLN-0128和CC-223等。

本课题组在咪唑酮并喹啉类PI3K/mTOR双重抑制剂BEZ-235的结构上采用破环策略，发现了高活性的mTOR选择性抑制剂，简述如下：

3,4-二取代氨基喹啉类：在Torin2和BEZ-235化学结构的基础上，一方面保留了Torin2和BEZ-235结合铰链区所必需的喹啉部分，采用开环策略并结合分子内氢键来维系其空间构象，另一方面考察喹啉母核C-3位不同取代基团(如氨基、乙酰胺基、甲磺酰胺基、三氟乙酰胺基和特戊酰胺基等)以及C-4位不同取代苯胺片段、C-6为不同杂环片段对活性的影响，获得了2个系列3,4-二取代氨基喹啉衍生物11和12[55-56](见图9)。活性测试结果表明，绝大多数4-取代氨基喹啉衍生物呈现出中等到强的mTOR抑制活性，近半数化合物抑酶活性突出，与阳性对照PI-103相当。构效关系研究表明，喹啉C-6位为喹啉或2-氨基吡啶取代的化合物活性明显较优，C-3位随着取代基团的增大其mTOR抑制活性的显著降低，喹啉C-4位不同的取代苯胺片段对活性影响不明显。以针对Torin2开环修饰所得的化合物11e为例，其mTOR抑制活性达到了31nM，而且对HCT-116、PC-3和MCF-7均具有显著的增殖抑制活性，IC50分别为1.29、3.90、0.44 μM。11e对4种ClassI PI3Ks的抑制效果均不明显(PI3Kα：2427 nM,PI3Kβ>5000nM，PI3Kγ：939nM，PI3Kδ>5000 nM)，显示了很高的选择性。化合物11e在MCF-7细胞株中对pS6(Ser235)和pAkt(Ser473)的下调作用。pS6(Ser235)和pAkt(Ser473)在本研究中可作为mTORC1和mTORC2的生物标志物，pAkt(Ser473)水平的升高提示S6K/IRS1/PI3K负反馈通路的释放。Western blot实验结果表明，11e和BEZ-235在0.5 μM浓度下均可显著下调pS6(Ser235)、pAkt(Ser473)水平，提示11e可同时抑制mTORC1和mTORC2。相比之下，相同浓度的雷帕霉素在下调pS6(Ser235)水平的同时，会导致pAkt(Ser473)水平的上调，从而提示S6K/IRS1/PI3K负反馈通路的释放。因而，11e可通过mTORC1、mTORC2的双重抑制，有效避免雷帕霉素选择性抑制mTORC1时负反馈通路释放导致的pAkt(Ser473)水平升高。

图9 3,4-二取代氨基喹啉类mTOR抑制剂Fig.9 The discovery of 3,4-disubsituted amino-quinoline derivatives as mTOR inhibitors

3 结语

PI3K-Akt-mTOR信号通路在肿瘤的发生发展过程中起关键作用，该信号通路的多个关键蛋白也是热门的药物作用靶点，与此相关的小分子抑制剂的研发已经获得了良好进展，和化疗药物及其他靶点药物联合用药能发挥强效的协同抗肿瘤活性。因此以PI3K-Akt-mTOR通路为靶点开发抗肿瘤小分子抑制剂将具有很好的前景。针对该通路不同关键蛋白，目前已有数十个候选药物进入了临床研究，包括泛PI3K抑制剂、亚型选择性PI3K抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、Akt抑制剂、mTOR选择性抑制剂。近年来，本课题组针对该通路的PI3K、Akt、mTOR蛋白，开展了一系列的合理药物设计、合成和抗肿瘤活性评价工作，并发现了结构新颖的活性化合物，为靶向PI3K-Akt-mTOR通路的小分子抑制剂的研究提供了新的思路和构效关系研究的数据支撑，同时，还优选了一些活性高效的小分子抑制剂(PI3K/mTOR双重抑制剂、Akt抑制剂)，目前正在开展体内药效、作用机制和成药性研究。

值得注意的是，不同类型的PI3K-Akt-mTOR通路靶向抑制剂的抗肿瘤效应略有不同，靶向该通路抑制剂与受体酪氨酸激酶抑制剂、靶向下游蛋白的抑制剂或者旁路蛋白的抑制剂联合用药在临床前的研究中表现突出，目前已经在临床上来考察是否具有能发挥最大的抗肿瘤效应，然而其临床疗效受多方面因素的影响，因此，极有可能需要根据不同的肿瘤类型来确定抑制剂的组合类型和使用方法。同时，还需要去发现一些新的生物标志物，尽可能避免使用一些在过去的靶向治疗研究中采取的不确定的或者偶然成功的方法。

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(编校：吴茜)

作 者 简 介

何俏军，博士，2005年毕业于浙江大学，目前为浙江大学药学院教授，博导，教育部新世纪优秀人才，任浙江大学药理毒理研究所所长和浙江大学药物安全评价研究中心主任。

何俏军教授研究领域主要包括：关键蛋白的翻译后调控模式在肿瘤分化及药物毒性过程中发挥的作用及相关信号转导通路，并基于此发现调控分化和药物毒性防治的新靶点和新型小分子药物。主持国家自然科学基金面上项目和重大研究计划项目、国家重大新药创制专项等国家级科研项目9项，在Oncogene,FASEBJ,CancerResearch,MolecularCancerTherapeutics等国际知名刊物发表SCI论文135余篇，获授权发明专利19项。获教育部科技进步二等奖、浙江省科技进步二等奖、中国专利优胜奖等奖项。并获得浙江省自然科学基金杰青团队、浙江省“新世纪151人才工程”一层次、浙江省卫生高层次创新人才等人才项目的支持，浙江省青年科技奖获得者。任中国毒理学会毒理学替代法与转化毒理学专业委员会常务委员、中国抗癌协会抗癌药物专业委员会委员、中国药理学会肿瘤药理与化疗专业委员会委员、中国药学会毒理学药物毒理与安全性评价专业委员会委员、浙江省药学会药物毒理学专业委员会主任委员。

Research progress of small molecule inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR pathway

HE Qiao-junΔ, DONG Xiao-wu, ZHU Hong, HU Yong-zhou, YANG Bo

(Institute of Pharmacology and Toxicology,Institute of Drug Discovery and Design, Zhejiang Province Key Laboratory of Anti-Cancer Drug Research,College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Aberrant activation of the phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)- protein kinase B(PKB,Akt)- mammalian target of rapamycin(mTOR)pathway is commonly observed in human cancer and is critical for cell survival,proliferation and differentiation.A variety of small molecule inhibitors targeting PI3K-Akt-mTOR pathway are under clinical studies.This review will summarize the recent studies in terms of the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway and cancer,research progress of the antitumor activity possessed by PI3K-Akt-mTOR inhibitors,as well as the recent research in the related field conducted by our group.

PI3K-Akt-mTOR pathway;small molecular inhibitor;cancer

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.002

何俏军，通信作者，男，教授，博士生导师，研究方向：肿瘤分子药理学，E-mail：qiaojunhe@zju.edu.cn。

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